مشخصات پژوهش

عنوان	مهندسی انزیم اوریکاز اسپرژیلوس فلاووس در موقعیت279 با استفاده از جهش زایی هدفدار برای بهبود پایداری حرارتی
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	اوریکاز، آسپرژیلوس فالووس، جهش زایی هدفدار، پایداری دمایی
چکیده	آنزیم اوریکاز یا اورات اکسیداز)UOX؛.1.7.33EC), اسید اوریک را در حضور اکسیژن مولکولی به 5_هیدروکسی ایزواورات و آب اکسیژنه تبدیل می کند که این ترکیب طی یک واکنش غیر آنزیمی به یک ترکیب قابل دفع به نام آالنتوئین و دی اکسید کربن تبدیل می شود. آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فالووس یک آنزیم هموتترامر است، دارای وزن مولکولی 135 کیلو دالتون و هر مونومر آن دارای 302 اسید آمینه با وزن مولکولی 34 کیلو دالتون می باشد. در این مطالعه اثر جهش بر پایداری آنزیم با جایگزینی اسید آمینهی آالنین با سیستئین در موقعیت 279 آنزیم اوریکاز با استفاده از جهش زاییِ هدفدار مورد بررسی قرار گرفت. جهش زایی هدفدار به روش PCR change-Quickبرای ایجاد جهش زایی نقطه ای با استفاده از DNA Taq HL Polymerase انجام شد. برای صحت اطمینان از انتقال پالسمید، باکتری ها را در محیط دارای آنتی بیوتیک کانامایسین کشت داده شدند. سپس استخراج پالسمید با استفاده از کیت استخراج پالسمید انجام شد، همچنین برای اطمینان ازکیفیت استخراج پالسمید، نمونه ها روی ژل آگاروز 1درصد بررسی شدند و سپس نمونه ها برای تعیین توالی ارسال شدند. سپس توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی نمونه ی وحشی و جهش یافته با یکدیگر مقایسه شدند و جهش تایید شد. برای بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب، پالسمیدUOX-)+(a-28PET به باکتری 21BL coli.E منتقل شد. برای این کار باکتری ها را در محیط کشت مایع که حاوی کانامایسین میباشد، به مدت 18 تا22 ساعت در دمای 37 درجه ی سانتیگراد با شیک 165 دور در دقیقه قرار گرفت تا رشد کنند. سپس آن را به یک محیط کشت انتقال داده تا به جذب حدود 0/7 تا 0/8 برسد، سپس (IPTG(0/8 میلی موالر به آن اضافه میشود و به مدت 6 تا 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده میشود تا القا انجام شود. برای خالص سازی پروتئینها از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی آگاروز (ABT (NTA-Ni استفاده شد. مقایسه مطالعات ساختاری آنزیم جهش یافته و وحشی با استفاده از فلورسانس ذاتی، خارجی)ANS )و FTIR انجام شد. فعالیت ویژه به روش اسپکتروفوتومتری بااستفاده از سوبسترای اسید اوریک در طول موج 293 نانومتر انجام شد. فعالیت ویژه پروتئین های نوع وحشی و جهش یافته به ترتیب 4/08 و 2/18 mg/u بود. pH بهینه و دمای بهینه برای آنزیم وحشی به ترتیب 9 و 25 درجه سانتی گراد بود، درحالی که برای آنزیم جهش یافته به ترتیب 8 و 25 درجه سانتیگراد به دست آمد. پارامتر های سینیتیکی شامل Km، Kcat و Km/Kcat برای آنزیم وحشی به ترتیب )mM)،0.089( -1 S)3/125 و ) -1 .S Mm-1 )35/112 به دست آمد، همچنین برای -1 آنزیم جهش یافته C279A به ترتیب )mM )0/055 ،( ( ،2/031)S -1 . S Mm-1 (36/931 به دست آمد. افزایش نشر فلورسانس ذاتی جهش یافته C279A در مقایسه با نوع وحشی بیانگر تغییرات ساختاری و قرارگرفتن تریپتوفان در محیط غیر قطبی است. افزایش شدت نشر فلورسانس با ANS در جهش یافته نسبت به نوع وحشی افزایش یافت که نشان دهندهی قرار گرفتن پاکت های هیدروفوب در سطح پروتئین است. با توجه به نتایج به دست آمده از ضریب volmer -stern مقدار خاموشی در پروتئین جهش یافته نسبت به نوع وحشی بیشتر بودکه نشان دهندهی دسترسی بیشتر خاموش کنندهی آکریل آمید به باقی ماندههای تریپتوفان است. نتایج حاصل ازFTIR نشان دهنده کاهش صفحات بتا در جهش یافته نسبت به نوع وحشی است و صفحات آلفا تغییری نکرده است. نتایج به دست آمده از مطالعات پایداری حرارتی نشان داد که آنزیم جهش یافته در دمای 50 و 30 درجه سانتیگراد افزایش پایداری نسبت به آنزیم وحشی داشت. همچنین نیمه عمر آنزیم نیز در دمای 50 و 30 درجه سانتیگراد نسبت به آنزیم وحشی بیشتر بود. مطالعات تجربی و بیوانفورماتیکی نشان داد که جایگزینی آالنین در موقعیت 297 به سیستئین می تواند باعث تغییراتی در ساختار آنزیم اوریکاز شود. با توجه به اهمیت این آنزیم در درمان و پیشگیری بیماری هایی مانند هایپر اوریسمی می توان با استفاده از روش هایی مانند مهندسی پروتئین به منظور جهش زایی برای تولید آنزیم پایدار استفاده کرد.
پژوهشگران	ملیحه سادات عطری (استاد راهنما)، مهدی ایمانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، معصومه همتی (دانشجو)