مشخصات پژوهش

عنوان	بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات آنزیم طبیعی و جهش یافته سوپراکسید دیسموتاز در ارتباط با بیماری ALS
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	: سوپراکسید دیسموتاز، بیان، آنزیم جهش‌یافته و طبیعی ، تخلیص، فلورسانس ذاتی و خارجی
چکیده	سوپراکسید دیسموتاز یک نوع آنزیم آنتی اکسیدان است که سوپر اکسید را به هیدروژن پراکسید و اکسیژن کاتالیز می‌کند. سوپراکسید دیسموتاز انسانی یک آنزیم همودایمر است که هر زیر واحد آن دارای یک بشکه‌ی بتا می‌باشد که از 8 رشته‌ی بتا تشکیل شده است که با هفت لوپ به همدیگر متصل شده است. هر زیر واحد دارای یک یون مس با نقش کاتالتیک و یک یون روی با نقش ساختاری می‌باشد. در این تحقیق از پلازمید pET-28a(+) حاوی ژن کد کننده سوپر اکسید دیسموتاز انسانی استفاده شد. جهش‌زایی هدفدار به روش Quick-change PCR انجام شد. محصول تکثیر با استفاده از آنزیم DpnI هضم و سپس به سلول ‌ BL21(DE3) E.coli با استفاده از روش شیمیایی (شوک حرارتی)منتقل شد. برای بیان پروتئین از القاء کننده IPTG ) 8/0 میلی مولار( و لاکتوز)5 میلی مولار( به مدت 18 ساعت در دمای 22 درجه سانتی گراد استفاده شد. تخلیص پروتئین با کروماتوگرافی تمایلی (ستون نیکل سفارز) انجام شد. جهت اطمینان ازخلوص پروتئین جهش یافته و طبیعی ازSDS-PAGE استفاده شد. سنجش فعالیت آنزیم و خصوصیات سنتیک آنزیم به وسیله جذب پیروگالول در 420 نانومتر به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر انجام گرفت. طیف فلورسانس ذاتی و خارجی به کمک دستگاه اسپکتروفلوریمتر در غلظت آنزیم 02/0 میلی گرم بر میلی لیتر انجام شد. نتایج ما نشان داد بیشترین فعالیت آنزیم طبیعی و جهش یافته به ترتیب U/mg 25/7031 وU/mg 63/6175 در غلظت 1/0 پیروگالول به دست آمد. دمای بهینه آنزیم جهش یافته 40 درجه سانتی گراد و دمای بهینه آنزیم طبیعی 30 درجه سانتی گراد به ترتیب با درصد مهار 55 % و 32% تعیین شد. دامنه ی دمای پایداری آنزیم طبیعی و جهش یافته به ترتیب بین 30 تا 50 درجه سانتی گراد و 20 تا 40 درجه ی سانتی گراد به دست آمد. مطالعات ساختاری با استفاده از فلورسانس ذاتی و خارجی با نشانگر ANS انجام شد. افزایش شدت فلورسانس ذاتی آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی نشان می دهد که ساختار آنزیم فشرده تر شده است. مطالعات فلورسانس خارجی با نشانگر ANS نشان می‌دهد شدت فلورسانس کاهش پیدا کرده است، که بیانگردسترسی کمتر پاکت‌های هیدروفوبیک در سطح می‌باشد. نتایج این پژوهش نشان داد جایگزینی اسیدآمینه سیستئین با گلایسین در موقعیت 72 باعث تغییرات سنتیکی و ساختاری آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی شده است. بنابراین، مطالعات ما نشان داد جهش در موقعیت 72 آنزیم SOD1 (G72S) تمایل به تجمع بیشتری نسبت به آنزیم طبیعی در ارتباط با ایجاد بیماری ALS دارد.
پژوهشگران	مجتبی محسنی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، سیده زهره هاشمی (دانشجو)