|
عنوان
|
جهش زایی هدفدار در لوپ ۶و صفحه ۲βژن سوپر اکسید دیسموتاز ۱انسانی به منظور بررسی بیان، تخلیص و خصوصیات آنزیم جهش یافته
|
|
نوع پژوهش
|
پایان نامه
|
|
کلیدواژه‌ها
|
سوپر اکسید دیسموتاز ، ۱جهش زایی هدف دار ، آنزیم جهش یافته ی ، G16Sآنزیم جهش یافته ی ، L106Vشبیه سازی دینامیک مولکولی
|
|
چکیده
|
آنزیم ها ی آنتی اکسیدانی در محافظت در برابر رادیکال های سمی اکسیژن که در متابولیسم های طبیعی و بعد از اکسیداسیون تولید می شوند، نقش دارند. سوپر اکسید دیسموتاز ۱انسانی ( )hSOD1یک آنزیم آنتی اکسیدانی است که رادیکال سوپر اکسید را به هیدروژن پراکسید و اکسیژن تبدیل می کند. بیش از ۱۰۰جهش در این آنزیم یافت شده است که باعث بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک ( )ALSمی شوند. هدف از این پژوهش بررسی تاثیر جهش های L106Vواقع در لوپ Ⅵو G16Sواقع در صفحه ی β۲ژن سوپر اکسید دیسموتاز ۱بر ساختار و فعالیت آن می باشد .در این مطالعه از پلاسمید (+) pET-28aکه حاوی ژن سوپر اکسید دیسموتاز ۱است استفاده شد. جهش زایی هدف دار با روش Quick-change PCRانجام شد .محصول تکثیر شده با استفاده از آنزیم DpnⅠهضم و به سویه DH5αباکتری E.coliبا استفاده از روش شیمیایی(شوک حرارتی) منتقل شد. پس از تایید جهش ، پلاسمید حاوی جهش به باکتری بیانی E.coliسویه ی ) BL21(DE3انتقال داده شد. برای بیان پروتئین از القا کننده های ۱ IPTGمیلی مولار و لاکتوز ۵میلی مولار برای مدت ۲۴ساعت در دمای ۲۲درجه سانتی گراد استفاده شد. خالص سازی پروتئین به روش کروماتوگرافی تمایلی با استفاده از ستون نیکل_سفارز انجام شد و برای تعیین خلوص پروتئین از ژل ۱۲/۵ SDS_PAGEدرصد استفاده شد .تعیین فعالیت ویژه آنزیم های جهش یافته و وحشی با استفاده از سوبسترای پیروگالول در طول موج ۴۲۰نانومتر با روش اسپکتروفتومتری ( طیف سنجی) انجام شد . مطالعات ساختاری با کمک تکنیکهای فلورسانس ذاتی وفلورسانس خارجی با نشانگر ANSانجام شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد که بیشترین فعالیت ویژه آنزیم وحشی برابر ۷۰۳۱/۲۵ U/mgآنزیم جهش یافته G16Sبرابر ۶۶۳۹/۲۴ U/mgو آنزیم جهش یافته L106Vبرابر ۷۲۳۸/۶۵ U/mgاست. مطالعات ساختاری با فلور سانس ذاتی نشان داد که شدت نشر فلور سانس ذاتی جهش یافته ی G16Sنسبت به حالت وحشی افزایش یافته و شدت نشر فلور سانس ذاتی جهش یافته ی L106Vبه طور جزئی کمتر از حالت وحشی است. افزایش شدت نشر فلورسانس خارجی با ANSدر جهش یافته ی L106Vنسبت به حالت وحشی بیانگر افزایش پاکت های سطحی هیدروفوب در مقایسه با آنزیم وحشی است. با استفاده از سرورهای مختلف، مطالعات بیوانفورماتیکی جهت بررسی پایداری و تغییرات ساختاری آنزیم وحشی و جهش یافته انجام شد . در شبیه سازی دینامیک مولکولی تا ثیرات جهش های نقطه ای بر ساختار و دینامیک پروتئین قابل ارزیابی است . با بررسی داده های حاصل از شبیه سازی دینامیک مولکولی باز شدگی ساختار جهش یافته ی L106Vنسبت به حالت وحشی به وسیله ی تغییرات شعاع ژیراسیون و افزایش انعطاف پذیری آن و در نتیجه کاهش پایداری توسط نتایج RMSFبه دست آمد، که همگرایی قابل توجهی را با یافته های آزمایشگاهی نشان داد. نتایج این آزمایشات همچنین درک ما ازتجمع SOD1را افزایش می دهد که ممکن است به تحقیقات آینده در درک آسیب شناسی ALSکمک کند
|
|
پژوهشگران
|
علی طراوتی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، نیلوفر لاری (دانشجو)
|