مشخصات پژوهش

عنوان	جهش‌زایی هدف‌دار در ژن سوپراکسید دیسموتاز 1 انسانی به منظور تولید و بررسی خصوصیات آنزیم جهش‌یافته در ناحیه‌ی رابط ‌دایمری
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	آنزیم‌های جهش‌یافته R115Gو E49K، جهش‌زایی هدف‌دار، رابط دایمری، سوپر اکسید دیسموتاز 1 انسانی
چکیده	آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز1 انسانی (SOD1) آنزیم آنتی اکسیدانی است که دو مولکول آنیون سوپر اکسید را به هیدروژن پراکسید و آب کاتالیز می‌کند. بیش از 180 نوع جهش در ژن کد کننده این آنزیم شناسایی شده که با فرم ارثی بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (FALS) در ارتباط است. بد تاخوردگی پروتئین ومتعاقبا، تشکیل تجمع پروتئینی از ویژگی‌های مشترک در بیمارهای تحلیل برنده‌ی سیستم عصبی از جمله آلزایمر، پارکینسون، هانتینگتون، پریون و ALS به شمار می‌آید. با استفاده از سرورهای مختلف، مطالعات بیوانفورماتیکی جهت بررسی پایداری و تغییرات ساختاری آنزیم‌های جهش یافته انجام شد. در این پژوهش، وکتور pET28-a(+) که حاوی ژنSOD1 می‌باشد با استفاده از روش جهش زایی هدفدارPCR) Quick-change) تکثیر شد. سپس محصول تکثیر شده با استفاده از آنزیم DpnI هضم و با استفاده از روش شیمیایی (شوک حرارتی) به سلول E.coli سویه BL21(DE3) منتقل شد. برای بیان در سیستم باکتریایی از القا کننده‌ی IPTG و لاکتوز استفاده شد. پروتئین تولید شده از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل- سفاروز تخلیص و میزان خلوص با SDS-PAGE بررسی شد. برای بررسی فعالیت ویژه از سوبسترای پیروگالول استفاده شد. مطالعات ساختاری با کمک تکنیک‌های فلورسانس ذاتی و فلورسانس خارجی با نشانگر ANS انجام شد. نتایج حاصل از این مطالعه، فعالیت ویژه آنزیم وحشی، جهش‌یافته E49K و R115G را به ترتیب U/mg 25/7031، U/mg 5536 و U/mg 43/4305 نشان داد. دمای بهینه آنزیم وحشی در دمای °C30، آنزیم جهش‌یافته E49K در دمای °C50 و آنزیم جهش‌یافته R115G، °C40 به دست آمد. دمای پایداری برای آنزیم وحشی، E49K و R115G به ترتیب °C70_20، °C40_20 و °C40_20 می‌باشد. مطالعات ساختاری با فلورسانس ذاتی نشان داد که شدت نشر فلورسانس آنزیم‌های جهش یافته E49K و R115G نسبت به حالت وحشی به ترتیب کاهش و افزایش یافته است که نشان دهنده تغییرات ساختاری در اشکال جهش یافته نسبت به حالت وحشی می‌باشد. افزایش شدت نشر فلورسانس خارجی با ANS در جهش یافته‌های E49K و R115G نسبت به نوع وحشی، بیانگر افزایش پاکت های سطحی هیدروفوب آنزیم‌های جهش‌یافته نسبت به آنزیم وحشی می باشد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان می‌دهد که، وقوع جهش در ناحیه‌ی رابط دایمری آنزیم SOD1 علت تغییرات ساختمان فضایی و ناپایداری آنزیم است. تغییرات ساختاری در جهش یافته R115G احتمالا، می‌تواند نتیجه‌ی از دست رفتن پیوند هیدروژنی، از دست رفتن میانکنش جایگاه 115 آنزیم با ایزولوسین 151 زنجیره متناظر و میانکنش‌های دیگر باشد. در جهش E49K نیز از دست رفتن میانکنش‌ها با وقوع جهش صورت گرفته است ولی با تعداد کمتری نسبت به جهش R115G، در هر صورت تغییرات ساختاری صورت گرفته روی آنزیم، اهمیت مهم آرژنین و گلوتامیک را درموقعیت رابط دایمری، مولکول SOD1 را نشان می‌دهد. نتایج ما پیشنهاد می‌دهد که جهش در ناحیه‌ی رابط دایمری باعث، احتمال افزایش مونومریزاسیون، افزایش انعطاف پذیری،کاهش پایداری و به طور قابل توجهی تمایل آنزیم جهش‌یافته به تشکیل تجمع پروتئین را افزایش می‌دهد.
پژوهشگران	سامان حسینخانی (استاد مشاور)، فاطمه رودباری (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، سید مهدی حسینی فرادنبه (دانشجو)