|
عنوان
|
بررسی مقایسه ای خواص ساختاری و ترمودینامیکی نوع وحشی و جهش یافته S126L سوپراکسید دیسموتاز انسانی در اشکال آپو و هولو و تشکیل تجمعات آمیلوئید
|
|
نوع پژوهش
|
پایان نامه
|
|
کلیدواژه‌ها
|
کلیدی:اسکلروز‌جانبی‌آمیوتروفیک،سوپراکسید‌دیسموتاز‌انسانی،1تجمع‌پروتئین،پایداری‌ساختاری،شبیه‌سازی دینامیک‌مولکولی
|
|
چکیده
|
سوپر‌اکسید‌دیسموتاز1انسانی)1SOD)،آنزیم‌آنتی‌اکسیدانی‌است‌که‌دو‌مولکول‌آنیون‌سوپر‌اکسید‌را‌به‌هیدروژن پراکسید‌و‌آب‌کاتالیز‌میکند.بیش‌از180نوع‌جهش‌در‌ژن‌کد‌کننده‌این‌آنزیم‌شناسایی‌شده‌که‌با‌فرم‌ارثی‌بیماری اسکلروز‌جانبی‌آمیوتروفیک)FALS)در‌ارتباط‌است.جهش‌های‌غالب‌مرتبط‌با1SODمنجر‌به‌تجمع‌پروتئین‌های تاخورده‌نادرست‌در‌بیماریهای‌نورودژنراتیو‌میشود،که‌یک‌عالمت‌پاتولوژیک‌کلیدی‌در‌اسکلروز‌جانبی‌آمیوتروفیک )ALS)است.آنزیم1SODپس‌از‌اتصال‌به‌مس/روی‌و‌تشکیل‌دی‌سولفید‌درون‌مولکولی‌ایجاد‌شده‌و‌به‌صورت آنزیمی‌فعال‌می‌شود.تجمع/الیگومریزاسیون1SODبا‌تفکیک‌یونهای‌مس‌و/یا‌روی‌ایجاد‌میشود.بنابراین،در‌تحقیق حاضر‌از‌روشهای‌بیوانفورماتیکی‌و‌بیوشیمیایی‌برای‌بررسی‌مقایسه‌ای‌تجزیه‌و‌تحلیل‌ترمودینامیکی‌نوع‌وحشی)WT)و جهش‌یافته S126L بدون‌فلز)آپو(و‌‌با‌فلز)هولو(،استفاده‌گردید‌تا‌مشخص‌شود‌که‌آیا‌بین‌پایداری‌ساختاری‌یا پایداری ترمودینامیکی و پایداری پروتئین در فرم های آپو و هولو1SOD و همچنین اثرات جهش بر پایداری ترمودینامیکی رابطه ای وجود دارد.همچنین برای تعیین خصوصیات ساختاری از روشهای طیفسنجی، محاسباتی و همچنین‌شبیهسازیهای‌دینامیک‌مولکولی)MD)استفاده‌شد.برای‌این‌منظور‌‌وکتور(+)a28-pETکه‌حاوی‌ژن1SODبود‌با‌استفاده‌از‌روش‌جهش‌زایی‌هدفدار(PCRchange-Quick)تکثیر‌شد.سپس‌محصول‌تکثیر‌شده‌با‌استفاده‌از آنزیم DpnI هضم‌و‌با‌استفاده‌از‌روش‌شیمیایی )شوک‌حرارتی(به‌سلولcoli .E سویه(3DE(21BL منتقل‌شد.برای بیان‌در‌سیستم‌باکتریایی‌از‌القا‌کنندهیIPTGو‌الکتوز‌استفاده‌شد.پروتئین‌تولید‌شده‌از‌طریق‌کروماتوگرافی‌تمایلی نیکل-آگارز‌تخلیص‌شد.برای‌بررسی‌فعالیت‌ویژه‌آنزیم‌از‌سوبسترای‌پیروگالول‌استفاده‌شد.تجزیه‌و‌تحلیل‌محاسباتی پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی نتایج مضر و بیثباتکننده جهش‌یافته1hSODرا پیش‌بینی کرد. تجزیه و تحلیل دادههایMD انعطافپذیری،پایداری‌و‌فشردگی‌باالتر‌را‌برای‌شکل1SOD WT-apo و‌جهش‌یافته‌نشان‌داد،که نشان‌میدهد‌جایگزینی‌و‌کمبود‌فلز‌میتواند‌فشردگی‌و‌آبگریزی‌پروتئین‌را‌در‌مقایسه‌با‌فرم‌هولو‌تغییر‌دهد.عالوه‌بر‌این، تمایل‌به‌تجمع‌و‌تغییرات‌آبگریزی‌باالتر1SOD-WTانسانی و‌جهش‌یافته S126Lدر‌فرم‌آپو،تحت‌شرایط‌احیائی)با حضور‌بافر‌فسفات 20 میلی‌موالر،pH برابر7/4 و50 DTT میلی‌موالر،KSCN 0/2 موالر،در C° 37 ،pH برابر7/4 (در‌مقایسه‌با‌فرم‌هولو‌با‌استفاده‌از‌نشر ThT و ANS تعیین‌گردید.فعالیت‌باالتر‌هولو‌در‌مقایسه‌با‌آپو 1SODبا‌مهار اکسیداسیون‌پیرو‌گالول‌اثبات‌شد.تحقیقات‌بیشتر‌در‌مورد‌تغییرات‌ساختار‌ثانویه‌برای‌ارزیابی‌ساختار‌فیبریل‌ها،با DSSP و FTIR انجام‌شده‌است‌که‌حاکی‌از‌افزایش‌در‌صفحات β ی‌باشد.پس‌از‌آن،کاهش‌پایداری‌ترمودینامیکی1SOD در‌فرم‌آپو‌نسبت‌به‌هولو‌در‌حضور DTT به‌خصوص‌در‌جهشS126Lتأیید‌شد. کاهش‌فعالیت‌آنزیمی‌و‌تغییرات ساختاری‌در1SOD-apo و S126Lدر‌مقایسه‌با‌فرمholoشدیدتر‌بود.کاهش‌شدت‌نشر‌فلورسانس‌ذاتی‌و‌خارجی اشکال‌آپو‌وهولوS126L نسبت‌به1hSOD-WT تغییرات‌در‌محیط‌محلی‌باقیمانده‌ی‌تریپتوفان‌و‌پاکت‌های‌آبگریز را‌نشان‌داد.دادههایMDنشان‌میدهد‌که‌کمبود‌فلزات‌جهش‌یافته)فرم‌آپو(در‌لوپ‌الکترو‌استاتیک‌ممکن‌است‌تمایل ه به‌تا‌شدن‌و‌تجمع‌پروتئین‌را‌افزایش‌دهد.به‌طور‌کلی،تجزیه‌و‌تحلیل‌دادههای‌فرمهای1SOD holo/apoدر‌جهت بررسی‌ساختار‌و‌عملکرد‌پروتئین‌با‌استفاده‌از‌مطالعات‌محاسباتی‌به‌درک‌بهتر‌اثرات‌آن‌روی‌بیماریزاییALSکمک
|
|
پژوهشگران
|
سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، فائزه آشکاران (دانشجو)
|