مشخصات پژوهش

عنوان	مطالعه عملکردی و ساختاری اشکال هولو و آپو نوع وحشی و جهش یافته‌ی (P66R)SOD1 مرتبط با ALS تحت شرایط فیزیولوژیکی
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	سوپراکسید دیسموتاز انسانی، فرم های هالو و آپو، موتانت P66R ، لوپ اتصال روی، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک
چکیده	آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز 1انسانی (SOD1)آنزیم آنتی اکسیدانی است که دو مولکول آنیون سوپر اکسید را به هیدروژن پراکسید و اکسیژن کاتالیز می کند. بیش از 180نوع جهش در ژن کد کننده این آنزیم شناسایی شده که با فرم ارثی بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (FALS) در ارتباط است. جهش های غالب مرتبط با SOD1منجر به تجمع پروتئین های تاخورده نادرست در بیماری های نورودژنراتیو می شود، که یک علامت پاتولوژیک کلیدی در ALSاست. SOD1 پس از اتصال به مس/روی و تشکیل دی سولفید درون مولکولی تثبیت شده و به صورت آنزیمی فعال می شود. تجمع/الیگومریزاسیون SOD1با تفکیک یون های مس و/یا روی ایجاد می شود. بنابراین، در این پژوهش اثرات احتمالی جهش نقطه ای مرتبط با ALSاشکال WT- holo/apo SOD1و P66R واقع در لوپ اتصال روی برای تعیین خصوصیات ساختاری با استفاده از روش‌های طیف سنجی، محاسباتی و همچنین شبیه سازی های دینامیک مولکولی (MD) مقایسه شد. وکتور (+) pET28-aکه حاوی ژن SOD1می‌باشد با استفاده از روش جهش زایی هدفدار Quick-change PCRتکثیر شد. سپس محصول تکثیر شده با استفاده از آنزیم DpnIتیمار و با استفاده از روش شوک حرارتی به سلول E. coli سویه BL21(DE3) منتقل شد. برای بیان در سیستم باکتریایی از القا کننده ی IPTG و لاکتوز استفاده شد. پروتئین تولید شده از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل- آگارز تخلیص شد. برای بررسی فعالیت ویژه از سوبسترای پیروگالول استفاده شد. تجزیه و تحلیل محاسباتی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی نتایج مضر و بی ثبات کننده جهش یافته hSOD1 را پیش بینی کرد. تجزیه و تحلیل داده های MD انعطاف پذیری، پایداری و فشردگی بالاتر را برای شکلholo-WT SOD1 و جهش یافته نشان داد، که نشان می دهد جایگزینی و کمبود فلز در لوپ اتصال روی می تواند فشردگی و آبگریزی پروتئین را در مقایسه با گونه های apo-WT و apo-SOD1تغییر دهد. علاوه بر این، کاهش فعالیت آنزیمی و تغییرات ساختاری در apo-SOD1 و P66R در مقایسه با فرم holo شدیدتر بود. کاهش شدت نشر فلورسانس ذاتی شکل آپو وافزایش شدت نشر فلورسانس شکل هولو P66R نسبت به WT-hSOD1تغییرات در محیط محلی باقی مانده ی تریپتوفان و پاکت های آبگریز را نشان داد. افزایش شدت نشر فلورسانس خارجی با ANSدر فرم هولو جهش یافته ی P66R نسبت به نوع وحشی، بیانگر باز شدگی ساختار و افزایش پاکت های سطحی هیدروفوب آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم وحشی می باشد. همچنین نتایج حاصل از نشر فلورسانس ThTو قرمز کنگو نشان دهنده ی حدواسط های تجمعات آمیلوئیدی بود، که این تجمعات در فرم آپو SOD1 بارزتر بود. نتایج بررسی ساختار دوم با استفاده از FTIR نشان دهنده ی افزایش صفحات بتا که با نتایج حاصل از DSSP شبیه سازی دینامیک مولکولی هم راستا بود. علاوه بر این، نتایج پایداری ترمودینامیکی حاصل از گوانیدین هیدروکلراید نشان دهنده‌ی کاهش پایداری apo-SOD1 نسبت به holo-SOD1 بود. در نهایت نتایج آزمایشگاهی و داده های MD نشان می دهد که کمبود فلزات جهش یافته (فرم آپو) در لوپ اتصال روی ممکن است تمایل به تا شدن و تجمع پروتئین را افزایش دهد. به طور کلی، تجزیه و تحلیل داده های فرم های apo/holo SOD1 بر روی ساختار و عملکرد پروتئین با استفاده از مطالعات محاسباتی به درک بهتر بیماری زایی ALSکمک می کند.
پژوهشگران	سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، رقیه فرخ زاد (دانشجو)