مشخصات پژوهش

عنوان	تولید و تعیین خصوصیات اوریکاز جهش یافته آسپرژیلوس فلاووس و بهبود پایداری حرارتی آن با طراحی درون رایانه‎ای و مهندسی جهش زایی هدفمند در موقعیت 224
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	آسپرژیلوس فلاووس، اوریکاز، پایداری دمایی، جهش‌زایی هدفدار
چکیده	اوریکاز یا اورات اکسیداز آنزیمی است فاقد کوفاکتور که باعث تبدیل اوریک اسید (کم محلول) به 5-هیدروکسی ایزواورات و آب اکسیژنه و در نهایت آلانتوئین می‌شود. افزایش اوریک اسید در انسان باعث بیماری‌هایی همچون نقرس و سنگ‌های کلیوی می‌گردد. بنابراین اوریکاز می‌تواند به عنوان یک آنزیم دارویی برای کاهش سطح اوریک اسید خون مورد استفاده قرار گیرد. یکی از مشکلات پیش روی آنزیم‌های دارویی پایداری کم آن‌ها در برابر حرارت می‌باشد که برای مقابله با این چالش راهکارهای مختلفی استفاده شده است که می‌توان به مهندسی پروتئین و دستکاری ژنتیکی اشاره کرد. برای بررسی خصوصیات آنزیم اوریکاز، مطالعات بیوانفورماتیک، شبیه سازی دینامیک مولکولی و تجربی انجام شد. از این‌رو، اثر جهش بر خصوصیات ساختاری و سنتیکی آنزیم با جایگزینی سرین به سیستئین در موقعیت 224 آنزیم اوریکاز با استفاده از روش جهش‌زایی هدف‌دار مورد بررسی قرار گرفت. جهش‌زایی هدف‌دار با روش Quick Change PCR به منظور ایجاد جهش تک نقطه‌ای با استفاده از HL Taq DNA پلیمراز انجام شد و پلاسمید نوترکیب pET-28a (+)-UOX به E. coli BL21 (DE3) به روش شوک حرارتی (کلسیم کلراید) منتقل شد. بیان پروتئین بعد از رسیدن جذب حدود 7/0 تا 8/0 با (IPTG) 8/0 میلی مولار و لاکتوز 8 میلی مولار به مدت 6 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد القاء شد. خالص‌سازی پروتئین‌ها با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی آگارز Ni-NTA انجام شد. برای ارزیابی پایداری ساختاری پروتئین جهش‌یافته، از روش‌های بیوانفورماتیک یکپارچه شامل i-Stable وi-Mutant استفاده شد. مقایسه و بررسی خصوصیات ساختاری با استفاده از فلورسانس ذاتی، خارجی (ANS) ، Quenching، FTIR و CD انجام شد. فعالیت ویژه با استفاده از سوبسترای اسید اوریک در طول موج 293 نانومتر به روش اسپکتروفتومتری تعیین گردید که برای آنزیم وحشی و جهش یافته به ترتیب 018/4 و 825/0 بود. پارامترهای سینتیکی شامل Kcat، Km و Kcat/Km برای آنزیم جهش‌یافته به ترتیب (S-1) 255/0 و (mM) 033/0 و (mM-1.S-1) 698/7 به‌دست آمد همچنین برای آنزیم وحشی نیز به ترتیب (S-1)125/3 ، (mM) 089/0 و(mM-1.S-1) 112/35 به‌دست آمد. pH و دمای بهینه‌ی آنزیم جهش‌یافته S224C به ترتیب حدود 5/9 و 25 درجه سانتی‌گراد مشخص شد، در حالی که برای نوع وحشی به ترتیب در 9 و 25 درجه سانتی‌گراد به دست آمد. در مطالعه‌ی پایداری حرارتی در دماهای مختلف پایداری آنزیم جهش‌یافته نسبت به نوع وحشی کمی افزایش داشته‌ است به طوری که در دمای 45 درجه سانتی گراد، نوع جهش‌یافته و نوع وحشی به ترتیب 25 و 20 درصد فعالیت داشتند. همچنین نیمه‌عمر آنزیم جهش‌یافته بیشتر از نوع وحشی به‌دست آمد. برای بررسی ساختار سوم از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی و سرورهای پیش‌بینی پایداری استفاده شد که پارامترهای Rg، H-bond، RMSF، RMSD و SASA نشان‌دهنده‌ی تغییرات موضعی ساختاری در موقعیت 224 آنزیم جهش‌یافته نسبت به تیپ وحشی بود که در نتیجه باعث ایجاد پروتئین با ویژگی‌های جدید آنزیمی می‌شود. در بررسی ساختار دوم افزایش نشر فلورسانس ذاتی برای جهش‌یافته S224C در مقایسه با نوع وحشی نشان‌دهنده تغییرات ساختاری و قرارگرفتن تریپتوفان در محیط غیرقطبی است. افزایش شدت نشر فلورسانس با ANS در جهش‌یافته نسبت به نوع وحشی حاکی از افزایش پاکت‌های آبگریز در سطح پروتئین است. همچنین مقدار خاموش‌کنندگی پروتئین جهش‌یافته بیشتر بود که گویای دسترسی بیشتر خاموش‌کننده آکریل‌آمید به باقی‌مانده‌های تریپتوفان است. نتایج طیف FTIR جهش‌یافته نشان‌دهنده کاهش ساختارهای β و افزایش مارپیچ α و رندوم‌کویل نسبت به نوع وحشی است که تاییدکننده‌ی نتایج حاصل ازشبیه‌سازی دینامیک مولکولی می‌باشد. نتایج طیف سنجی CD آنزیم جهش‌یافته نسبت به آنزیم نوع وحشی تغییرات ساختاری محسوسی نداشته است. مطالعه‌ی شبیه‌سازی دینامیک مولکولی و ساختاری نشان داد که جهش در موقعیت 224 باعث تغییرات ساختاری، خصوصیات ترمودینامیکی و سینتیکی نسبت به آنزیم تیپ وحشی شد. بنابراین، استفاده از آنزیم جهش‌یافته با ویژگی‌های جدید برای تولید آنزیم دارویی می‌تواند مهم باشد.
پژوهشگران	مهدی ایمانی (استاد مشاور)، زهرا ویسی (دانشجو)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)