|
چکیده
|
اورات‌اکسیداز آنزیمی در تجزیه پورین‌ها است. اوریکاز عملکردی در آسپرژیلوس‌فلاووس یک پروتئین هموتترامر کروی با وزن مولکولی 135 کیلودالتون می‌باشد و هر مونومر دارای 302 اسیدآمینه و وزن مولکولی 34.5 کیلو دالتون است. اوریکاز تجزیه اسیداوریک و تولید آلانتوئین را کاتالیز می‌کند. اوریکاز انسانی فاقد عملکرد بوده و محصول نهایی این کاتابولیسم اسیداوریک است، که دلیل آن وجود جهش بی‌معنی در ژن این آنزیم می‌باشد. هایپراوریسمی نتیجه تجمع اسیداوریک می‌باشد. شکل نوترکیب اورات‌اکسیداز (راسبوریکاز) جهت درمان هایپراوریسمی حاد در بیماران تحت شیمی‌درمانی استفاده گردید. یکی از نقص‌های قابل‌توجه پروتئین‌های دارویی مانند اورات‌اکسیداز (UOX) پایداری کم آنهاست. بنابراین می‌توان از مهندسی پروتئین برای بهبود پایداری حرارتی آنزیم استفاده کرد. هدف از این پژوهش بررسی تاثیر جهش E172I ژن اورات‌اکسیداز بر فعالیت، پایداری و خصوصیات ساختاری می‌باشد. در این مطالعه توالی اسیدآمینه اوریکاز از پایگاه داده UniProt استخراج و توسط سرورهای بیوانفورماتیکی چون: I-Mutant , iStable DynaMut , PremPS , Hope Server بررسی شد تا پایداری جهش E172I تایید شود. جهت انجام این تحقیق از پلاسمید PET-28a(+) دارای ژن اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس استفاده شد. به کمک روش Quick-change PCR عمل جهش‌زایی هدفمند صورت گرفت. عمل هضم محصول PCR با استفاده از آنزیم DpnI انجام شد. سپس به روش شوک‌حرارتی به باکتری E.coli-DH5α منتقل شد. پس از تعیین و تایید توالی جهش E172I، پلاسمید حاوی جهش به باکتری بیانی E.coli-BL21(DE3) منتقل شد. بیان به کمک القاکننده‌های IPTG (1میلی مولار) و لاکتوز(8 میلی مولار) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 6-7 ساعت با شیک 240rpm صورت گرفت. تخلیص آنزیم به کمک کروماتوگرافی تمایلی نیکل-آگارز انجام شد. خلوص آنزیم جهش‌یافته از طریق الکتروفورز SDS-PAGE تایید شد. تعیین فعالیت آنزیم جهش‌یافته و وحشی با استفاده از اسیداوریک (100میکرومولار) به عنوان سوبسترا در بافر بورات 50 میلی‌مولار با pH 9 در طول موج 293 نانومتر تعیین شد .پارامترهای سینتیکی شامل Km ,Kcat Kcat/Km با استفاده از اسیداوریک(4-2000 میکرومولار) به عنوان سوبسترا در دمای 25 درجه سانتی‌گراد تعیین شد. به‌منظور بررسی پایداری حرارتی، آنزیم‌ها در دماهای مختلف انکوبه شدند. برای بررسی پایداری حرارتی آنزیم در زمان‌های مختلف و غیرفعال‌سازی حرارتی برگشت‌ناپذیر، آنزیم‌ها در دماهای(30،40،50،60) انکوبه شدند. همچنین پایداری ذخیره‌سازی آنزیم وحشی و جهش‌یافته در دماهای (20-،37،25،4) به مدت 7 ماه بررسی شد. پایداری آنزیم در pH های مختلف در دمای 25 درجه سانتی‌گراد بررسی شد. برای مطالعه ساختارهای دوم و سوم، از روش‌هایی مانند طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه و فلورسانس ذاتی و خارجی استفاده شد. خاموشی فلورسانس تریپتوفان با آکریل‌آمید انجام شد. نمودارهای استرن ولمر F0/F در مقابل[Q] برای انالیز داده ها استفاده شد. در این پژوهش، فعالیت ویژه پروتئین جهش‌یافته نسبت به وحشی افزایش یافت. مقدار Km، Kcat و کارایی کاتالیتیکی آنزیم جهش‌یافته به‌ترتیب (0.232 mM)، (1.49 s-1) ، (6.45 1/mM.s) و برای پروتئین وحشی (0.304 mM) ، (0.4 s-1) ، (1.31/Mm.s) محاسبه شد. دمای بهینه و pH بهینه برای آنزیم جهش‌یافته دمای 30 درجه سانتی‌گراد و pH برابر 6/8 به‌دست آمد و برای پروتئین وحشی به ترتیب 25 درجه سانتی‌گراد و pH برابر 9 محاسبه شد. ثابت غیرفعال شدن در دماهای (20-، 4، 25، 37) جهش E172I نسبت به پروتئین وحشی افزایش یافت که بیان‌کننده کاهش نیمه عمر جهش‌یافته E172I در این دماها می‌باشد. آنزیم جهش‌یافته بهترین ذخیره و پایداری نگهداری را در دمای 4 و 25 درجه سانتی‌گراد نشان داد. افزایش ساختار α-helix و کاهش β-sheet در مطالعات ساختار دوم به‌وسیله FT-IR بیانگر تغییرات ساختاری در آنزیم جهش‌یافته می‌باشد. نتایج فلورسانس ذاتی نشان‌دهنده کاهش نشر و افزایش جزئی طول‌موج (Red shift) و قطبی‌شدن محیط پیرامون تریپتوفان در آنزیم جهش‌یافته می‌باشد و همچنین افزایش فلورسانس خارجی(ANS) ، در معرض قرار گرفتن پاکت‌های هیدروفوب سطحی در آنزیم جهش‌یافته را تائید می‌کند. افزایش خاموشی فلورسانس آنزیم جهش‌یافته نسبت به وحشی نشان دهنده دسترسی بیشتر آکریل‌آمید به تریپتوفان می‌باشد و قطبی‌شدن محیط اطراف تریپتوفان را توجیه می‌کند. با توجه به اهمیت بالای آنزیم اوریکاز در درمان بیماری هایی چون نقرس، راهکارهایی نظیر مهندسی پروتئین و شبیه سازی دینامیک مولکولی به منظور توسعه اشکال با پایداری بالای آنزیم برای مصارف دارویی می تواند حائز اهمیت باشد.
|