مشخصات پژوهش

عنوان	ایجاد جهش در ژن سوپر اکسید دیسموتاز با استفاده از تکنیک جهش زایی هدفدار جهت غربالگری آنزیمی با ویژگی جدید
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	سوپر اکسید دیسموتاز،جهش یافته G114A، G108V ، جهش زایی هدفدار ، فلورسانس ذاتی، فلورسانس خارجی
چکیده	سوپر اکسید دیسموتاز ها آنزیم های آنتی اکسیدانی هستند که با دیسموتاسیون آنیون سوپر اکسید به پراکسید هیدروژن و مولکول اکسیژن نقش بسیار مهم و عمده ای در حذف رادیکال های آزاد بر عهده دارند. سوپر اکسید دیسموتاز مس/روی (Cu/Zn SOD) یک آنزیم درون سیتوپلاسمی است که توسط ژن سوپراکسید دیسموتاز کد می گردد. جهش در ژن SOD1 باعث ایجاد بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) می شود. در این پژوهش، وکتور pET28-a که حاوی ژنSOD1 می باشد با استفاده از روش جهش زایی هدفدار PCR) Quick-change) تکثیر شد. سپس محصول تکثیر با استفاده از آنزیم DpnI هضم و با استفاده از روش شیمیایی(شوک حرارتی) به سلول E.coli سویه BL21(DE3) منتقل شد. برای بیان در سیستم باکتریایی از القا کننده ی IPTG و لاکتوز استفاده شد. پروتئین تولید شده از طریق کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل سفاروز تخلیص و میزان خلوص پروتئین با SDS-PAGE بررسی شد. به منظور بررسی تاثیر میزان جهش بر فعالیت آنزیم از غلظت های 0.1-0.8میلی مولار سوبسترای پیروگالل استفاده شد. به منظور بررسی تاثیر جهش بر دمای بهینه و پایداری دمایی، آنزیم در معرض دمای 20-90 درجه سانتی گراد قرار داده شد. در نهایت با استفاده از فلورسانس ذاتی وفلورسانس خارجی با نشانگر ANS تاثیرات جهش بر ساختار آنزیم مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد که بیشترین فعالیت آنزیم وحشی در غلظت 0.1 میلی مولار برابر u/mg 7031، آنزیم جهش یافته G108V در غلظت 0.3 میلی مولار برابر u/mg 78/3859 و آنزیم جهش یافته G114A در غلظت 0.2 میلی مولار برابرu/mg 21/18719محاسبه شد. با بررسی خصوصیات دمایی آنزیم در دمای 20-90 ، دمای بهینه آنزیم وحشی در دمای 30 درجه سانتی گراد وآنزیم جهش یافته G108V در دمای 40 درجه سانتی گراد بدست آمد. دامنه پایداری دمایی برای آنزیم جهش یافته ی G108V و نوع وحشی 40-20 درجه سانتی گراد می باشد. مطالعات ساختاری با فلورسانس ذاتی نشان داد که شدت نشر فلورسانس آنزیم های جهش یافته G114A و G108V نسبت به حالت وحشی افزایش یافته است که نشان دهنده تغییرات ساختاری در اشکال جهش یافته نسبت به حالت وحشی می باشد. افزایش شدت نشر فلورسانس خارجی با ANS در جهش یافته G108V نسبت به نوع وحشی بیانگر افزایش پاکت های سطحی هیدروفوب آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم وحشی می باشد. نتایج ارائه شده نشان می دهد، وقوع جهش در موقعیت 108 و 114 آنزیم SOD1 باعث تغییر در فعالیت و پایداری آنزیم جهش یافته نسبت به وحشی شده، همچنین مطالعات ساختاری نشان داد جهش در SOD1 باعث تغییرات کنفورماسیون جزئی در نواحی وقوع جهش شده و به دنبال این تغییرات موضعی، جهش یافته ها ناپایدار شده و افزایش هیدروفوبیسیته ی سطحی در مقایسه با آنزیم وحشی مشاهده شد.
پژوهشگران	سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، رضا روزبهان (دانشجو)