|
عنوان
|
جهش‌زایی هدفدار در لوپ الکترواستاتیک ژن سوپراکسید دیسموتاز به منظور تولید وبررسی آنزیم جهش یافته و مقایسه خواص این آنزیم با نوع native آن
|
|
نوع پژوهش
|
پایان نامه
|
|
کلیدواژه‌ها
|
جهش‌زایی هدفدار، سوپراکسید دیسموتاز، آنزیم جهش یافته C146R، آنزیم وحشی
|
|
چکیده
|
آنزیم سوپراکسید دیسموتاز انسانی(SOD1) دو مولکول O2- را به H2O2 و O2 کاتالیز می‌کند. این متالو آنزیم همودایمراست و حاوی یک یون مس و یک یون روی است. بیش از 100 جهش در این آنزیم شناخته شده است که با بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک ( (ALS در ارتباط است. هدف این پژوهش بررسی تاثیر جهش C146R درژن سوپراکسید دیسموتاز بر ساختار و فعالیت آن می‌باشد. در این تحقیق از پلاسمید pET-28a(+)که حاوی ژن سوپراکسید دیسموتاز است استفاده شد. بعد از طراحی پرایمر، از روش جهش زایی هدفدار (PCR Quick change) جهت ایجاد جهش استفاده شد. محصول تکثیر شده به سویهDH5α باکتری E.coli با استفاده از روش شیمیایی (شوک حرارتی) انتقال داده شد. پس از تایید جهش، پلاسمید حاوی جهش به داخل باکتری بیانی BL21(DE3) E.coliانتقال داده شد. برای بیان پروتئین از IPTG (0.8mM) و لاکتوز (mM5) استفاده شد. به مدت 18 ساعت در دمای °C 22 انکوبه شد. خالص سازی پروتئین با کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل -سفارز انجام و میزان خلوص پروتئین از طریقSDS-PAGE بررسی شد. غلظت پروتئین جهش یافته و وحشی از روش برادفورد تعیین شد. در این تحقیق جهت تعیین فعالیت ویژه آنزیم، دمای بهینه و پایداری آنزیم جهش‌یافته و وحشی، از پیروگالول در طول موج 420 نانومتر استفاده شد. فعالیت ویژه آنزیم جهش یافته بیشتر از آنزیم وحشی بدست آمد. دمای بهینه برای آنزیم وحشی و جهش یافته °C30 و °C 40 به ترتیب بدست آمد. مطالعات پایداری دمایی نشان داد که دامنه پایداری آنزیم وحشی°C 40-20 و دامنه دمایی آنزیم جهش یافته°C 60-20 می-باشد. مطالعات ساختاری برای بررسی آنزیم خالص شده با استفاده از فلورسانس ذاتی انجام شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد جهش در C146R باعث افزایش شدت فلورسانس شده که نشان دهنده تغییر در ساختار و فشردگی آنزیم جهش یافته در مقایسه با آنزیم وحشی می‌باشد. مطالعات فلورسانس خارجی نشان داد شدت نشر فلورسانس آنزیم حاوی جهش C146R از آنزیم وحشی کمتر بوده است. بنابراین ساختار آنزیم جهش یافته فشرده تر شده و پاکت های هیدروفوبی کمتر در سطح قرار می‌گیرد. نتایج حاصل نشان می‌دهد که جایگزینی اسید آمینه آرژنین با سیستئین در موقعیت 146 باعث تغییرات ساختاری، تجمع پروتئین و در نهایت ممکنه منجر به تشکیل آمیلوئید شود.
|
|
پژوهشگران
|
سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، سعیده محمدی (دانشجو)
|