مشخصات پژوهش

عنوان	جایگزینی لوسین به پرولین و فنیل آلانین در موقعیت 106 سوپراکسید دیسموتاز انسانی با استفاده از جهش زایی هدفدار به منظور بررسی خصوصیات ساختاری آنزیم
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	جهش زایی هدفدار، سوپر اکسید دیسموتاز1 انسانی، جهش یافته‌ی L106P و L106F، لوپ VI
چکیده	آنزیم سوپراکسید دیسموتاز انسانی (SOD1) یک همودیمر 32 کیلو دالتون است و هر زیر واحد آن دارای یک یون مس، یک یون روی و یک پیوند دی سولفیدی درون مولکولی می باشد. بیش از 180 جهش مختلف در ژن SOD1 در ارتباط با بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک گزارش شده است که بسیاری از این جهش ها به دلیل جایگزینی آمینواسید می باشد. بیماری های عصبی مانند آلزایمر، بیماری پارکینسون، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک و ها نتینگتون معمولا با تجمع پروتئین های نادرست در داخل سلول یا خارج سلول، تشکیل می شوند. در این پژوهش با جایگزینی اسیدآمینه های لوسین به پرولین و فنیل آلانین(L106P و L106F) در موقعیت 106، تاثیر جهش یافته ها بر فعالیت و خصوصیات ساختاری و مقایسه آن ها با پروتئین وحشی مورد بررسی قرار گرفت. برای بررسی تغییرات ساختاری از نرم افزار شبیه سازی دینامیک مولکولی و به منظور ارزیابی پایداری از سرورهای مختلفی استفاده شد. در این پژوهش از وکتور (+)pET- 28a که حاوی ژن کد کننده سوپراکسید دیسموتاز 1 است، استفاده شد و بعد از طراحی پرایمرها، جهش زایی هدفداربا روش (Quick-change PCR) انجام شد. محصول تکثیر با استفاده از آنزیم DpnI هضم و به باکتری BL21(DE3) E.coli به روش شیمیایی(شوک حرارتی) منتقل شد. برای بیان پروتئین، از القاء کنندهIPTG 1 میلی مولار و لاکتوز 7 میلی مولار به مدت 16 الی 18 ساعت در دمای 22 درجه سانتی گراد و با شیک rpm 220 استفاده شد. جهت تخلیص پروتئین از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل آگارز و برای اطمینان ازخلوص پروتئین جهش یافته و طبیعی، SDS-PAGE انجام شد. سنجش فعالیت آنزیم جهش یافته ها و وحشی به وسیله سوبسترا پیروگالول در طول موج 420 نانومتر، با روش اسپکتروفتومتری انجام گرفت. مطالعات ساختاری با دستگاه اسپکتروفلوریمتر، طیف فلورسانس ذاتی و خارجی با نشانگر ANS انجام شد. نتایج حاصل از تمامی سرورهای بیوانفورماتیکی مطالعه شده، تاثیر مخرب جهش بر ساختار پروتئین را نشان دادند. با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی تاثیرات جهش های نقطه ای بر خصوصیات ساختاری و دینامیکی پروتئین بررسی شد که نشان دهنده‌ی تغییرات ساختاری و تاثیر جهش بر ساختار آنزیم بود. نتایج این پژوهش نشان داد بیشترین فعالیت آنزیم طبیعی و جهش یافته های L106P و L106F به ترتیب U/mg25 /7031، U/mg8/1942، U/mg 5/2812 در غلظت 1/0 پیروگالول می باشد. افزایش نشر فلورسانس ذاتی برای هر دوجهش یافته ‌ نسبت به تیپ وحشی نشان دهنده تغییرات ساختاری و قرار گرفتن تریپتوفان در محیط غیرقطبی می باشد. نتایج مطالعات ساختاری فلورسانس خارجی با نشانگر ANS نشان داد که در جهش یافته L106P افزایش نشر فلورسانس که حاکی افزایش پاکت‌های هیدروفوب و در جهش یافته L106F کاهش نشر فلورسانس که بیانگر کاهش پاکت‌های هیدروفوب در سطح پروتئین بود. به طور کلی نتایج ما نشان داد، جهش در لوپ VI منجر به بد تاخوردگی پروتیئن شده و تمایل به تشکیل آمیلوئید را افزایش داده و ارتباط با بیماری ALS را تسهیل می‌کند. همچنین مطالعات بیشتر بر روی این لوپ 6 به تایید بیماری زایی و ارتباط آن با فنوتیپ بیماری ALS کمک می کند.
پژوهشگران	سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، نسترن نمدیان (دانشجو)