مشخصات پژوهش

عنوان	تغییر بار در موقعیت 137 و 138 آنزیم سوپراکسید دیسموتاز انسانی با استفاده از جهش زایی هدفمند به منظور بررسی ساختار آمیلوئیدی
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	سوپراکسید دیسموتاز انسانی ، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک ، جهش زایی هدفمند ، نوترکیب T137R و G138E
چکیده	سوپراکسید دیسموتاز انسانی (hSOD1) یک آنزیم آنتی اکسیدانی است که در سلول های یوکاریوتی بسیار محافظت می شود. hSOD1 کاتالیز دو آنیون سوپراکسید که حاصل تنفس سلولی غیرطبیعی است ، به پراکسید هیدروژن و اکسیژن را انجام می دهد. hSOD1 یک پلی پپتید 32 کیلو دالتونی است که یک همودیمر را تشکیل می دهد که هر مونومر آن حاوی یک یون مس و روی با پیوند دی سولفیدی می باشد. جهش های G138E و T137R که به بیماری FALS مرتبط هستند در حلقه الکترواستاتیک قرار دارند (حلقه VII ، باقی مانده 121-142). هدف از این مطالعه بررسی تأثیر جهش های G138E و T137R بر خصوصیات ساختاری و تشکیل فیبریل آمیلوئید می باشد. در این مطالعه ، شبیه سازی MD با GROMACS انجام شد و تأثیر جهش ها در حلقه الکترواستاتیک را بر روی ساختار و پویایی hSOD1 بررسی کرده ایم. وکتور pET28-a(+)، که حاوی ژن SOD1 است ، جهش زایی هدفمند با استفاده از روش Quick-change PCR انجام شد. محصول تولید شده با استفاده از DpnI هضم و با استفاده از روش شیمیایی (شوک حرارتی) به E. coli DH5α منتقل شد. پس از تایید توالی آنزیم وحشی و آنزیم های جهش یافته در Ecoli-BL21 (DE3) در دمای 22 درجه سانتی گراد به مدت 16 ساعت بیان و با کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز تخلیص شد. تایید خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE صورت گرفت . فلزدهی آنزیم ها با دیالیز چند مرحله ای صورت گرفت که شامل مرحله حذف فلزات ، شارژ فلزات و حذف فلزات اضافی می باشد. پس از تعیین غلظت پروتئین، فعالیت ویژه با استفاده از پیروگالول در طول موج 420 نانومتر با روش اسپکتروفتومتری تعیین شد. مطالعات ساختاری مقایسه ای شامل اندازه گیری فلورسانس ذاتی و طیف دورنگ نمایی دورانی (CD) انجام شد. در این مطالعه، تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی آنزیم hSOD1 و دو جهش یافته با شرایط القاء آمیلوئید (KSCN 0.2 M ، DTT 50 mM و 50 mM Tris) در دمای 37 درجه سانتی گراد و pH 7.4 ایجاد شد. تشکیل تجمعات آمیلوئیدی با توانایی آن ها در افزایش فلورسانس تیوفلاوین تی ((ThT و طیف های جذبی کنگو قرمز (CR) بررسی شد و همچنین مورفولوژی آنها با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) ارزیابی شد. فعالیت ویژه جهش یافته های WT-SOD1 و G138E و T137R به ترتیب به صورت U/mg 12434 ، U/mg 12163 و U/mg 7802 به دست آمد. طیف های CD به وضوح تغییرات ساختاری در SOD1 را در طول پیشرفت تجمع نشان می دهد. کاهش قابل ملاحظه ای در شدت نشر فلورسانس برای جهش یافته G138E مشاهده شد که نشان دهنده ی تغییر اساسی در شکل فضایی و جابه جایی تریپتوفان به محیط قطبی می باشد. همچنین افزایش فلورسانس ANS برای جهش های G138E و T137R مشاهده شد که دسترسی بیشتر به پاکت های آبگریز روی سطح پروتئین را نشان می دهد. فیبریلاسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد با شیک 190 rpm، زمان تاخیری را قبل از افزایش فلورسانس تیوفلاوین T نشان می دهد. فاز مرحله تأخیر برای جهش یافته ها و WT-SOD1 متفاوت است. کوتاه شدن فاز مرحله تأخیر درجهش یافته های G138E و T137R در مقایسه با WT-SOD1 مشاهده شد. افزایش نشر فلورسانس تیوفلاوین T جهش یافته ها در مقایسه با WT-SOD، در شدت های مختلف مشاهده شد. میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) طیفی از مورفولوژی ها را شامل فیبریل ها ، تجمعات دانه ای بی شکل و تجمعات فراکتالی بی شکل نشان داد. نتایج ارائه شده در این پژوهش نقش رزیدوهای حلقه الکترواستاتیک در تجمع آمیلوئیدی مطرح می کند و نشان دهنده تأثیر مستقیم حلقه الکترواستاتیک در آسیب شناسی FALS است.
پژوهشگران	اباصلت حسین زاده کلاگر (استاد مشاور)، سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، الهه مودت (دانشجو)