مشخصات پژوهش

عنوان	بررسی لوپ اتصال روی درآنزیم سوپر اکسید دیسموتاز انسانی به منظور تشکیل ساختار آمیلوئیدی بااستفاده از جهش زایی هدفمند
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	سوپر اکسید دیسموتاز 1 انسانی، جهش زایی هدفمند، پروتئین‌های جهش یافته‌ی L67P و D76Y، جایگاه اتصال
چکیده	سمیت گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) از عوامل اصلی دخیل در سرطان، پیری، بیماری‌های قلبی، آسیب‌های سلولی کبد و بیماری‌های تحلیل برنده‌ی سیستم عصبی می‌باشد. یکی از مهم‌ترین مکانیسم‌های آنتی‌ اکسیدانی بدن در برابر حمله‌ی گونه‌های فعال اکسیژن، حضور و فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) است. آنزیم ‌های سوپراکسید دیسموتاز واکنش دیسموتاسیون آنیون سوپراکسید (O2-) به اکسیژن و پراکسید هیدروژن را کاتالیز می‌کنند. حدود 20 درصد از موارد خانوادگی بیماری ALS در ارتباط با نقص ژنتیکی وراثتی بر روی کروموزوم ۲۱ (کدگذار برای سوپراکسید دیسموتاز) می باشد. تا به امروز ، 180 جهش مختلف در SOD1 مرتبط با این بیماری گزارش شده است. هدف از این پژوهش بررسی تاثیر جهش‌های D76Y و L67P واقع در لوپ IV ژن سوپر اکسید دیسموتاز 1 بر فعالیت، خصوصیات ساختاری و تشکیل تجمعات آمیلوئیدی می‌باشد.در این پژوهش از پلاسمید pET-28a(+) که حاوی ژن سوپر اکسید دیسموتاز 1 است استفاده شد. بعد از طراحی پرایمر، جهش زایی هدفمند با روش PCR Quick-change انجام شد. محصول تکثیر شده با استفاده از آنزیم DpnⅠ هضم و به سویه DH5α باکتری E.coli با استفاده از روش شیمیایی(شوک حرارتی) منتقل شد. پس از تعیین توالی جهش مورد نظر ، پلاسمید حاوی جهش به باکتری بیانی E.coli سویه ی BL21(DE3) انتقال داده شد. برای بیان پروتئین از القاء کننده های IPTG (1mM) و لاکتوز 7 میلی مولار به مدت 16تا 18 ساعت در دمای ۲۲ درجه سانتی گراد با شیک 220 استفاده شد. تخلیص پروتئین‌ با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل آگاروز،و آنالیز پروتئین تخلیص شده با استفاده از SDS-PAGE به منظور تایید خلوص پروتئین انجام شد. بعد از تعیین غلظت پروتئین، فعالیت ویژه آنزیم های جهش یافته و طبیعی با استفاده از سوبسترای پیروگالول در طول موج ۴۲۰ نانومتر با روش اسپکتروفتومتری ( طیف سنجی) انجام شد . مطالعات ساختاری با کمک تکنیک‌های طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی (CD)، فلورسانس ذاتی وفلورسانس خارجی با نشانگر ANS انجام شد. به منظور بررسی روند تشکیل تجمعات آمیلوئیدی از نشر فلورسانس ANS و تیوفلاوینT و همچنین طیف جذبی قرمز گنگو و به منظور تایید آن از میکروسکوپ الکترونی عبوری استفاده شد. براساس نتایج حاصل از این مطالعه، فعالیت ویژه پروتئین تیپ وحشی و جهش یافته‌های L67P و D76Y به ترتیب U/mg 12345، U/mg 11381 و U/mg9662 بدست آمد. نتایج حاصل از شبیه سازی دینامیک مولکولی و سرورهای پیش بینی پایداری و فعالیت نشان دادند که جهش در جایگاه اتصال یون روی) (Zn+ باعث از دست رفتن اتصال فلز که منجر به تغییرات ساختاری و در نتیجه باعث ناپایداری و بد تاخوردگی پروتئین می شود. نتایج طیف CD بیانگر این بودکه هر دو جهش یافته نسبت به تیپ وحشی تغییرات ساختاری داشته و تمایل به تشکیل ساختار صفحات بتا را نشان می‌دهد. کاهش نشر فلورسانس ذاتی هر دو جهش یافته نسبت به تیپ وحشی نشان دهنده تغییرات ساختاری و قرار گرفتن تریپتوفان در محیط قطبی تر می باشد. افزایش شدت نشر فلورسانس خارجی با نشانگر ANS در هر دو جهش یافته نسبت به تیپ وحشی بیانگر افزایش پاکت‌های هیدروفوب در سطح پروتئین نسبت به تیپ وحشی می‌باشد. همچنین نتایج حاصل از نشر فلورسانس ThT و قرمز کنگو نشان از حدواسط‌های تجمعات آمیلوئیدی می باشد به طوری که مورفولوژی اشکال مختلف توسط میکروسکوپ الکترونی این فرضیه را تائید کرد. نتایج ما پیشنهاد می‌دهد که جهش در ناحیه اتصال فلز روی، احتمال افزایش از دست دادن اتصال فلز و بدتاخوردگی، افزایش انعطاف پذیری، کاهش در پایداری و به طور قابل توجهی تمایل جهش یافته‌ها به تشکیل حدواسط‌های تجمعات آمیلوئیدی را افزایش می‌دهد.
پژوهشگران	احسان نظیفی (استاد مشاور)، سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، پیام بازیار (دانشجو)