مشخصات پژوهش

عنوان	افزایش پایداری و کارایی سینتیکی آنزیم اوریکاز اسپرژیلوس فلاووس با استفاده از جهش زایی هدفدار در قطعه ی 250 تا 270
نوع پژوهش	پایان نامه
کلیدواژه‌ها	اسپرژیلوس فلاووس، اوریکاز، پایداری دمایی، جهش زایی هدفدار
چکیده	اوریکاز یا اورات اکسیداز (EC 1.7.3.3; UOX) یک آنزیم هموتترامر بدون کوفاکتور است که تبدیل اسید اوریک به 5-هیدروکسی ایزورات و هیدروژن پراکسید را کاتالیز می کند، 5-هیدروکسی ایزواورات یک حدواسط ناپایدار است که می تواند تحت هیدرولیز خود به خود یا آنزیمی به آلانتوئین تبدیل شود. از UOX آسپرژیلوس فلاووس (یا راسبوریکاز) برای درمان هیپراوریسمی استفاده می شود. اوریکاز Aspergillus flavus یک هموتترامر با وزن مولکولی 135 کیلو دالتون است. آنزیم مونومر دارای 302 اسید آمینه با وزن مولکولی 34 کیلو دالتون است. برای افزایش پایداری پروتئین های دارویی، مطالعات بیوانفورماتیک و تجربی متعددی انجام شد. در این مطالعه، اثر جهش بر پایداری آنزیم با جایگزینی گلوتامین با لوسین در موقعیت 269 آنزیم اوریکاز با استفاده از روش جهش‌زایی هدفدار‌ مورد بررسی قرار گرفت. جهش زایی هدف دار با روش Quick-Change PCR برای ایجاد جهش تک نقطه ای با استفاده از HL Taq DNA پلیمراز انجام شد. برای اطمینان از انتقال پلاسمید، باکتری ها در محیط حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین) کشت داده شدند. برای اطمینان بیشتر، استخراج پلاسمید با استفاده از کیت استخراج پلاسمید miniprep انجام شد. پس از اطمینان از کیفیت استخراج پلاسمید از طریق بررسی روی ژل آگارز 1 درصد، نمونه ها برای تعیین توالی ارسال شدند. سپس، توالی نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی نمونه‌های نوع وحشی و جهش‌یافته با هم مقایسه شدند و جهش تایید شد. برای بیان و خالص سازی پروتئین نوترکیب، پلاسمید بیانی نوترکیب pET-28a (+)-UOX به E. coli BL21 (DE3) منتقل شد. ابتدا، باکتری‌ها در 5 میلی‌لیتر محیط کشت مایع (LB) حاوی 5 میکرو‌گرم بر میکرولیتر کانامایسین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد (با شیک 160 دور در دقیقه) به مدت 18 تا 22 ساعت (کشت شبانه) رشد کردند. پس از تلقیح در یک کشت 100 میلی لیتری و رسیدن به جذب حدود 0.7 تا 0.8 در 600 نانومتر، 220 دور در دقیقه، با (IPTG) 0.8 میلی مولار به مدت 6 تا 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد القا انجام شد. خالص سازی پروتئین ها با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی آگارز Ni-NTA (ABT) انجام شد. برای ارزیابی پایداری ساختاری پروتئین جهش یافته، از روش‌های بیوانفورماتیک یکپارچه شامل i-Stable و سرور DUET استفاده شد. مقایسه ی مطالعات ساختاری با استفاده از فلورسانس ذاتی، خارجی (ANS) و FTIR انجام شد. فعالیت ویژه با استفاده از سوبسترای اسید اوریک در طول موج 293 نانومتر به روش اسپکتروفتومتری انجام شد. فعالیت ویژه پروتئین های نوع وحشی و جهش یافته به ترتیب 018/4 و 926/3 U/mg بود. پارامترهای سینتیکی شامل Km، kcat و kcat/km برای جهش یافته به ترتیب (mM)163/0 ،(S-1) 104/15 و(mM-1.s-1) 662/92 به دست آمد. همچنین برای آنزیم وحشی نیز به ترتیب (mM) 336/0،(S-1) 568/26 و(mM-1.s-1) 073/79 به دست آمد. pH و دمای بهینه برای فعالیت جهش یافته Q269L به ترتیب حدود 5/9 و 30 درجه سانتی گراد بود، در حالی که برای نوع وحشی به ترتیب در 9 و 25 درجه سانتی گراد به دست آمد. نتایج شبیه سازی دینامیک مولکولی و سرورهای پیش بینی پایداری نشان داد که جایگزینی گلوتامین در موقعیت 269 به لوسین منجر به تغییرات ساختاری موضعی و در نتیجه باعث پایداری پروتئین می شود. کاهش نشر فلورسانس ذاتی برای جهش یافته Q269L در مقایسه با نوع وحشی نشان دهنده تغییرات ساختاری و قرار گرفتن تریپتوفان در محیط قطبی تر است. افزایش شدت نشر فلورسانس با ANS در جهش یافته نسبت به نوع وحشی نشان دهنده افزایش پاکت های آبگریز در سطح پروتئین است. با توجه به ضریب Stern-Volmer، مقدار کوئنچ پروتئین جهش یافته بیشتر بود که نشان دهنده دسترسی بیشتر خاموش کننده آکریل آمید به باقی مانده های تریپتوفان است. نتایج طیف FTIR جهش یافته نشان دهنده کاهش ساختارهای β و افزایش مارپیچ α نسبت به نوع وحشی است که با نتایج شبیه‌سازی دینامیک مولکولی همخوانی دارد. مطالعات پایداری حرارتی در دماهای مختلف پایداری آنزیم جهش یافته را بیشتر از نوع وحشی نشان داد به طوری که در دمای 45 درجه سانتی گراد، نوع جهش یافته و نوع وحشی به ترتیب 50 و 20 درصد فعالیت داشتند. همچنین نیمه عمر جهش یافته بیشتر از نوع وحشی بود. علاوه بر این، پارامترهای ترمودینامیکی ΔH، ΔS و ΔG در دمای 40 درجه سانتی گراد برای آنزیم جهش یافته به ترتیب KJ.mol-1 9/60 ، J.mol-1.k-1276- و KJ.mol-1 3/147 به دست آمد. در این مطالعه، نتایج بیوانفورماتیک و مطالعات تجربی نشان داد که جایگزینی Gln به Leu در موقعیت 269 می‌تواند به صورت موضعی ساختار را تغییر داده و آنزیمی نسبتاً پایدار در برابر حرارت ایجاد کند. با توجه به اهمیت بالای آنزیم اوریکاز در پیشگیری و درمان بیماری هایی مانند نقرس و قیمت بالای این داروی وارداتی، با استفاده از راهکارهایی مانند سایت مهندسی پروتئین جهت جهش زایی و شبیه سازی به منظور توسعه اشکال با پایداری بالای آنزیم ها به عنوان مصارف دارویی. می تواند مهم باشد.
پژوهشگران	مهدی ایمانی (استاد مشاور)، محمد پاژنگ (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، منا اخلاقی (دانشجو)