|
عنوان
|
مطالعه پایداری ترمودینامیکی آپو و هولو آمیوتروفیک اسکلروز جانبی مرتبط با موتانت ایزو لوسین 149 سوپراکسید دیسموتازانسانی
|
|
نوع پژوهش
|
پایان نامه
|
|
کلیدواژه‌ها
|
اسکلروز جانبی آمیوتروفیک، سوپراکسید دیسموتاز انسانی 1، تفکیک دایمر، رابط دایمر، تجمع پروتئین، پایداری ساختاری، شبیه سازی دینامیک مولکولی
|
|
چکیده
|
آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز1 انسانی (SOD1) آنزیم آنتی اکسیدانی است که دو مولکول آنیون سوپر اکسید را به هیدروژن پراکسید و آب کاتالیز می کند. بیش از 180 نوع جهش در ژن کد کننده این آنزیم شناسایی شده که با فرم ارثی بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (FALS) در ارتباط است. جهش های غالب مرتبط با SOD1 منجر به تجمع پروتئین های تاخورده نادرست در بیماری های نورودژنراتیو می شود، که یک علامت پاتولوژیک کلیدی در اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) است. SOD1 پس از اتصال به مس/روی و تشکیل دی سولفید درون مولکولی تثبیت شده و به صورت آنزیمی فعال می شود. تجمع/الیگومریزاسیون SOD1 با تفکیک یون های مس و/یا روی ایجاد می شود. بنابراین، در این پژوهش اثرات احتمالی جهش نقطه ای مرتبط با ALS اشکال holo/apo انواع WT SOD1 و I149Tواقع در رابط دایمر برای تعیین خصوصیات ساختاری با استفاده از روش های طیف سنجی، محاسباتی و همچنین شبیه سازی های دینامیک مولکولی (MD) مقایسه شد. وکتور pET28-a(+) که حاوی ژنSOD1 می باشد با استفاده از روش جهش زایی هدفدارPCR) Quick-change) تکثیر شد. سپس محصول تکثیر شده با استفاده از آنزیم DpnI هضم و با استفاده از روش شیمیایی (شوک حرارتی) به سلول E. coli سویه BL21(DE3) منتقل شد. برای بیان در سیستم باکتریایی از القا کننده ی IPTG و لاکتوز استفاده شد. پروتئین تولید شده از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل- آگارز تخلیص شد. برای بررسی فعالیت ویژه از سوبسترای پیروگالول استفاده شد. تجزیه و تحلیل محاسباتی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی نتایج مضر و بی ثبات کننده جهش یافته hSOD1 را پیش بینی کرد. تجزیه و تحلیل داده های MD انعطاف پذیری، پایداری و فشردگی بالاتر را برای شکل holo-WT SOD1 و جهش یافته نشان داد، که نشان می دهد جایگزینی و کمبود فلز در سطح مشترک دایمر می تواند فشردگی و آبگریزی پروتئین را در مقایسه با گونه های apo-WT و apo-SOD1 تغییر دهد. علاوه بر این، کاهش فعالیت آنزیمی و تغییرات ساختاری در apo-SOD1 و I149T در مقایسه با فرم holo شدیدتر بود. کاهش شدت نشر فلورسانس ذاتی شکل آپو وافزایش شدت نشر فلورسانس شکل هولو I149T نسبت به WT-hSOD1 تغییرات در محیط محلی باقی مانده ی تریپتوفان و پاکت های آبگریز را نشان داد. افزایش شدت نشر فلورسانس خارجی با ANS در فرم هولو جهش یافته ی I149T نسبت به نوع وحشی، بیانگر باز
|
|
پژوهشگران
|
سامان حسینخانی (استاد مشاور)، باقر سیدعلیپور (استاد راهنما)، حیدر منذر (دانشجو)
|