|
عنوان
|
بهبود پایداری آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس با استفاده از جهش زایی هدفدار در موقعیت 269
|
|
نوع پژوهش
|
مقاله ارائه شده
|
|
کلیدواژه‌ها
|
اوریکاز، اشریشیاکلی BL21، پایداری دمایی، جهش زایی نقطه ای
|
|
چکیده
|
اورات اکسیداز (EC 1.7.3.3) نقش مهمی را در مسیر تجزیه ی پورین ها داشته و باعث کاتالیز اوریک اسید به 5_هیدروکسی ایزواورات و هیدروژن پراکسید می شود که در نهایت به آلانتوئین تبدیل می شود. در روند تکامل انسان، در اثر جهش در ژن اورات اکسیداز و ایجاد کدون خاتمه زودرس، ترجمه ی این آنزیم در انسان مهار شده بنابراین باعث عدم تجزیه اسیداوریک می گردد. تجمع اسید اوریک در بدن می تواند منجر به هایپر اوریسمی و نقرس شود. شکل دارویی این آنزیم، راسبوریکاز است. پروتئین های دارویی در برابر عوامل متعدد از جمله افزایش دما ناپایدار می شوند. که برای مقابله با این مشکل می توان از دستکاری ژنتیکی و مهندسی پروتئین استفاده کرد. هدف این مطالعه جایگزینی اسیدآمینه ی گلوتامین به لوسین در موقعیت 269 آنزیم اوریکاز جهت بهبود و افزایش پایداری آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس می باشد. دراین تحقیق از پلاسمید pET28a(+) حاوی ژن اوریکاز و باکتری E.coli سویه BL21 (DE3) مورد استفاده قرار گرفت. جهش زایی هدفدار به روش Quick-change PCR به منظور ایجاد جهش تک نقطه ایی با استفاده از Pfu DNA polymerase انجام شد. pET28a-UOX به E. coli BL21 ترنسفرم شد، سلول های توانمند با استفاده از روش شوک حرارتی ایجاد شدند (کلرید کلسیم). جهت اطمینان از انتقال پلاسمید، باکتری ها روی محیط حاوی آنتی بیوتیک مناسب (کانامایسین) کشت داده شدند. برای اطمینان بیشتر، استخراج پلاسمید در حجم کم با استفاده از کیت استخراج پلاسمید صورت گرفت. پس از حصول اطمینان از کیفیت استخراج پلاسمید از طریق بررسی بر روی ژل آگارز 1% نمونه ها جهت تعیین ترادف ارسال شدند. توالی یابی با استفاده از یک توالی سنجی خودکار توسط پرایمرهای جهانی پروموتر T7 انجام شد. پروتئین های نوع وحشی و جهش یافته در E. coli-BL21(DE3) ، در دمای 37 درجه سانتی گراد، در 230 دور در دقیقه به مدت 7 ساعت بیان شدند و با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA آگارز خالص شدند. غلظت پروتئین با روش برادفورد تعیین و بر روی ژل 12% SDS-PAGE آنالیز شد. پس از تخلیص آنزیم، دمای بهینه و پایداری حرارتی آنزیم جهش یافته در دامنه دمایی (0-60 درجه سانتیگراد) با نمونه وحشی مقایسه شد و نتایج حاکی از دمای بهینه و پایداری دمای بالاتر آنزیم جهش یافته در مقایسه با تیپ وحشی می باشد. بنابراین، نتایج ما بینش هایی را برای به
|
|
پژوهشگران
|
محمد پاژنگ (نفر چهارم)، مهدی ایمانی (نفر سوم)، باقر سیدعلیپور (نفر دوم)، منا اخلاقی (نفر اول)
|