احسان نظیفی

سوپر اکسید دیسموتاز (SOD1) 1یک آنزیم آنتی اکسیدان است که جهش در آن باعث ایجاد بیماری اسکلروز جانبی آمیوتروفیک ) (ALSمی- شود. تا کنون بیش از 170جهش در آنزیم SOD1با الگوی ارثی ALSگزارش شد که⸲ تجمع این پروتئین با ویژگی های پاتولوژیکی این بیماری مرتبط است. در این تحقیق اسید آمینه آسپارتات جایگزین گلیسین ) (G41Dشد، سپس فعالیت و ساختار آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی مورد بررسی قرار گرفتند. در این پژوهش از پلاسمید )+( pET-28aکه حاوی ژن سوپراکسید دیسموتاز است⸲ استفاده شد. با استفاده از نرم افزار Oligo 7پرایمرها طراحی و برای ایجاد جهش از روش جهشزایی هدفدار ) (Quick-change PCRاستفاده شد. محصول تولید شده با استفاده از آنزیم Dpn1هضم و سپس با روش شیمیایی به باکتری E. coli DH5αانتقال داده شد. القای بیان پروتئین تحت تاثیر IPTGو لاکتوز و بررسی آن روی ژل الکتروفورز SDS-PAGEارزیابی شد. بعد از تخلیص پروتئین با ستون کروماتوگرافی نیکل-سفاروز و دیالیز، فعالیت آنزیم با استفاده از پیروگالول در طول موج 420نانومتر با روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد. مقایسه ساختاری آنزیم طبیعی و جهش یافته به وسیلهی شدت نشر فلورسانس ذاتی و خارجی در غلظت 0/02میلی گرم بر میلی لیتر انجام شد. بیشترین فعالیت ویژه آنزیم طبیعی و جهش یافته ) 7031 (U/mgو ) 5744 (U/mgبه ترتیب محاسبه شد. مطالعات فلورسانس ذاتی نشان داد شدت فلورسانس در آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی افزایش یافته که نشان دهنده قرار گیری اسید آمینه تریپتوفان در محیط غیر قطبیتر میباشد. مطالعات فلورسانس خارجی نشان داد، شدت فلورسانس جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی کاهش پیدا کرده است که بیانگر فشردهتر شدن ساختار و کاهش پاکتهای هیدروفوبیک در سطح میباشد. در نتیجه مشخص شد که این جهش باعث تغییرات موضعی در ساختار آنزیم شده⸲ که در نهایت باعث فشردگی آن میشود