محمد جواد چایچی

خ چکیده آنزیم سوپراکسیددیسموتاز3انسانی(SOD1)نوعیمتالوآنزیمآنتیاکسیدانیمیباشدکهمیتواندمولکولآنیون سوپراکسید را بهپراکسیدهیدروژن واکسیژنتبدیلکند.تقریبا444جهشدرژنکد کنندهیاینآنزیمشناسایی شده کهمنجر به ایجاد حالتارثی بیماریALS(fALS) میشود.تاخوردگیاشتباهپروتئینمیتواند باعثتشکیل تجمعات پروتئینیشود، کهاین حالتاز ویژگیهای مشترکبیماریهای تحلیل برندهی سیستم عصبیمانندALS،آلزایمر، هانتینگتونوپارکینسونمیباشد.در جستجوی عاملی برای سرکوب تشکیلساختارهایآمیلوئیدی،مایعاتیونی کاندیدهایبالقوهی خوبیهستند.در میان جهشهای مرتبطباALSکه در آنزیمSOD1رخمیدهدهدف قرار دادن جهشE49Kبه دلیل تاثیری که بر ساختار پروتئین دارد؛میتواند انتخاب خوبی برای درک مکانیسم پاتولوژیکSOD1 دربیماریALSباشد.با ایجادجهشE49Kدر رابط دایمروقرارگیریتحت شرایطناپایدارکنندهیدمای13درجه سانتیگراد، شیک444وDTT04میلیمولار،SOD1انسانیمورد بررسی قرار گرفت.به منظور تولید پروتئیننوترکیب، پلازمیدpET-28aحاوی ژنhSOD1با جهشE49KوسویهیBL21(DE3)باکتریE.coliکه مناسبترین سویه برای تولید پروتئینهای نوترکیب استبه عنوان میزبان بیانی استفاده شد.جهتبیانپروتئینازIPTGmM3ولاکتوزmM 3استفادهشدوبه مدت34ساعت در دمای44درجه سانتی گرادقرار گرفتو در ادامه برای خالص سازی پروتئینستون کروماتوگرافیتمایلیNi-NTAبه کار گرفته شد وغلظت پروتئینجهشیافتهباروش برادفورد تعیینشد.سپس اثرمایع یونیاتیلآمونیومبرومید(EAB) را با به کارگیریروشهایتجربیو بیوانفورماتیکبررسیکردیمکه بنا بر غلظت استفاده شده تا چه حد از تشکیلآمیلوئیدجلوگیریکردهاست.مطابقنتایجحاصل از شبیهسازیدینامیکمولکولی، جهشE49K باعثایجادتغییراتی درساختار پروتئیننسبت به حالت بومی آنشدهاست کهپس از برهمکنش باEABاینتغییرات ساختاری ایجاد شدهکاهش یافت.این نتیجه بر اساس تجزیه و تحلیل پارامترهایی نظیرRMSD،RMSF،SASAوRg تاییدشد.همچنین بررسیها از نظرچشمانداز انرژیآزاد(FEL)نشان دادکه تشکیل کمپلکسپروتئین جهشیافته و EABحوضههایانرژیآزاد مطلوب چندگانهرا ایجاد میکندومطابقبررسیماتریکسکوواریانسنیززمانیکهEABبا جهشیافتهE49Kبرهمکنش داد،اتمهایجهشیافتهE49Kکه حرکت همبستگینشان میدادند،کاهشیافتند.با بررسی نتایجفلورسانسذاتیپروتئینجهشیافته در حضور غلظتهای مختلف ازEABنشان داده شد،با افزایشغلظتآنمقادیر نشر کاهش پیدا میکندکهاین نتیجه بیانگرتغییراتساختاریمثبتدر پروتئیناست.مقادیرSVKوqKبه دست آمده پس از رسم نمودار استرن-ولمربهترتیب برابر1- M034×30و1- S1- M034×3گزارششد.طبق نتایجفلورسانس خارجیپروتئینبا نشانگرANS،شدت نشر مربوط به آنزیمجهشیافتهمقدار کمترینسبت به حالت کمپلکسE49K- EABرا نشان میدهد، چون پس ازبرهمکنش با مایعیونیسطوح هیدروفوبمجددا در مقادیرمتغیردر معرض حلال قرار میگیرد.مطابق نتایج بررسیتغییرتاخوردگیو افزایشتشکیلتجمعات پروتئینجهشیافتهبااستفادهازطیفنشری فلورسانس تیوفلاوینT(ThT،)پس از برهمکنشآنزیمبا غلظتهایمتفاوتEABبا افزایشغلظتآنشدت نشر فلورسانسThTکاهشیافتومقدارappKو فاز تاخیری(phaseLag) نیزبرایهریکاز نمونهها در حضور غلظتهای مختلفEABمحاسبه شدکه این مقدار در غلظت04میلی مولار ازEABبه ترتیب−1 h14/4و13ساعت گزارش شد. نتایج تستFTIRتحتشرایطالقاءآمیلوئید، تغییرات مربوط بهساختار ثانویهآنزیم جهشیافته و کمپلکسE49K-EAB را نشان دادکه با نتایج حاصل از بررسی شعاع ژیراسیون، در بخش مطالعات شبیه سازی دینامیک مولکولی مطابقت داشت. تصاویرTEMبرای انجاممطالعات ساختارینشان داد،شبکهایاز رشتههایخوشه مانند فیبرهایآمیلوئیددر نمونههای SOD1جهشیافتهوجوددارد ومشاهدات بهوضوح اثرEABرا بر تشکیلفیبریلهایآمیلوئیدSOD1در محدوده غلظت مورد مطالعه نشان میدهد.در نتیجه،EABرا میتوانبه عنوانیکنامزد احتمالیبرایمهار تجمعSOD1مرتبط باALS پیشنهادداد.نتایج این پژوهش نشان داد با ایجاد جهشE49Kدر رابطدایمر آنزیمSOD1انسانی و شرایط ناپایدار کننده، آمیلوئید تشکیل خواهد شد وEABباعث مهار تشکیل آمیلوئید میشود. همچنین؛ هر غلظتی از اتیل آمونیوم برمید تاثیر متفاوتی در روند تشکیل گونههای مختلف آمیلوئید دارد.