باقر سیدعلیپور

آنزیم DT – دیافوراز که با نام NAD(P)H Oxidoreductase ، (NQO1)، و کد شناسایی EC Number : 1.6.99.2 شناخته می شود، در گروه آنزیم های فلاوپروتئینی از خانواده اکسید و ردوکتازها قرار می گیرد. مرکز ردوکس در این آنزیم FAD می باشد که بعنوان مرکز تبادل الکترون مورد استفاده قرار می گیرد. این آنزیم به کمک NADH بعنوان دهنده ی الکترون، واکنش تبدیل ترکیبات مختلف را بهم کاتالیز می کند. دارای نقش های مهم در احیا و فعال سازی داروهای شیمی درمانی و جلوگیری از سمیت کوئینون ها در بدن اشاره کرد و با توجه به نقش این آنزیم در ساخت بیوسنسورها مربوط به تست های آزمایشگاهی مانند: PKU، MSUD، گالاکتوزومی و همچنین بیوسنسورهای میزان گلوگز از اهمیت ویژه ای برخوردار است. هدف از این تحقیق ، بهینه سازی شرایط بیان، مدت زمان القا و میزان القاگر ها، که ژن آنزیم DT – دیافوراز کلون شده در سویه بیانی BL21 E.Coli است. سپس به منظور خالص سازی آنزیم DT-دیافوراز از ستون کروماتوگرافی نیکل – سفارز استفاده گردیده. سنجش فعالیت آنزیم و خصوصیات سینتیکی آنزیم، به وسیله افزایش جذب NADH در طول موج 585 نانومتر در حضور سوبسترای نیتروبلوتترازولیوم به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر انجام گرفت. همچنین میزان پایداری حرارتی و فعالیتی آنزیم مورد نظر در حضور غلظت های متفاوتی از اسمولیت ساکارز مورد بررسی قرار گرفت. طیف فلوروسانس ذاتی جهت بررسی تغییرات ساختاری آنزیم در غیاب و حضور غلظت های متفاوتی از اسمولیت ساکارز ( 5/0 ، 75/0 ، 1 مولار) در دماهای متفاوت 40 و50 درجه سانتی گراد توسط دستگاه اسپکتروفلوریمتر انجام شد. نتایج این مطالعه نشان داد غلظت های متفاوت اسمولیت ساکارز در دمای 40 درجه سانتی گراد تاثیر بر ساختار آنزیم نداشته است در حالیکه در دمای50 درجه سانتی گراد، غلظت 75/0 مولار ساکارز تا حدودی از میزان کاهش نشر فلوروسانس و واسرشته شدن ساختارکاسته شد. طی بررسی فرایند بهینه سازی بیان آنزیم در سویه BL21، میزان غلظت بهینه برای القاکننده ی لاکتوز 5 میلی مولار و IPTG یک میلی مولار و مدت زمان بهینه برای القا، 22 ساعت تعیین شد. همچنین طی بررسی های انجام شده بر تاثیر غلظت های متفاوت از اسمولیت بر فعالیت آنزیم، مشخص گردید که اسمولیت ساکارز تاثیری بر پایداری حرارتی فعالیت آنزیم نداشته است. با سنجش فعالیت آنزیم در غلظت های متفاوتی از NADH بعنوان