باقر سیدعلیپور

تجمع و تشکیل رسوبات آمیلوئیدی نامحلول معمولاً در بیماریهای تخریبکننده عصبی مشاهده میشود، اما عوامل آغازگر و تعدیلکننده برهمکنشهای غیرطبیعی پروتئین-پروتئین که منجر به الیگومریزاسیون میشوند، ناشناخته باقی مانده است. اسکلروز جانبی آمیوتروفیک ( )ALSشایع ترین بیماری دژنراتیو نورون حرکتی در بزرگسالان است و همچنین ثابت شده است که یک نوع بیماری ساختاری مرتبط با تاخوردگی و اختلال عملکرد پروتئین است. سوپراکسید دیسموتاز )SOD1( 1اولین و گسترده ترین ژن مورد مطالعه مرتبط با بیماری ALSاست. جهش در SOD1که باعث افزایش خاصیت سمی آن میشود، دلیل اصلی ALSخانوادگی ( )fALSاست. استراتژیهای درمانی زیادی برای مهار تجمع پروتئین طراحی و اعمال شده است. مولکولهای کوچکی مانند یونهای معدنی و ترکیبات طبیعی برای یافتن مهارکنندههای قوی برای مقاومت در برابر تجمع پروتئینهای مختلف به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفتهاند. بسیاری از مطالعات نشان دادهاند که مایعات یونی ( )ILsبه عنوان کاندیدهای مناسبی برای مهار آمیلوئید از طریق برهمکنش با واسطههای مختلف تشکیل شده در طول مسیر تجمع میباشند. بر همین اساس ما برآن شدیم با استفاده از مایع یونی -1بوتیل -3متیل ایمیدازولیوم تیوسیانات ( )BMISCNمهار گونههای مختلف تجمع حاصل از آنزیم SOD1حاوی جهش R115Gمرتبط با بیماری ALSرا با استفاده از روش بیوانفورماتیکی و روش تجربی مورد مطالعه قرار دهیم. پارامتر های شبیه سازی دینامیک مولکولی مانند SASA ،H-bond ،DSSP ،Rg ،RMSF ،RMSDو چشم انداز انرژی آزاد ( )FELبررسی شدند. در روش تجربی از وکتور pET-28aبه عنوان الگو برای ایجاد جهش به روش Quick-change PCRاستفاده شد و محصول PCRبا روش شوک حرارتی به سویه DH5αباکتری E.coliمنتقل گردید. پس از تعیین توالی جهش مورد نظر، پلاسمید به باکتری E.coliسویهی ( BL21(DE3انتقال داده شد و به منظور بیان پروتئین با IPTGالقا شد و با استفاده از ستون میل ترکیبی Ni-NTAخالص شد و طیف سنجی فلورسانس ذاتی، خارجی با نشانگر ،ANSفلورسانس تیوفلاوین FTIR ،)ThT( Tو میکروسکوپ الکترونی عبوری ( )TEMانجام شد. نتایج نشان داد نوسانات RMSDدر زنجیره Aبرای جهشیافته R115G نسبت به تیپ وحشی کاهش پیدا کرد که با اتصال BMISCNبه جهشیافته نوسانات افزایش یافت و به یک حالت پایدار رسید و به فرم وحشی پروتئین نزدیک شد. در پارامتر RMSFانعطاف پذیری زنجیره Aدر جهشیافته R115Gدر بعضی نقاط نسبت به تیپ وحشی افزایش پیدا کرد که با اتصال BMISCNبه پروتئین، انعطاف پذیری کاهش یافت و به تیپ وحشی نزدیک شد. پیوند هیدروژنی در جهشیافته R115Gنسبت به فرم وحشی کاهش پیدا کرد که با اتصال BMISCN به جهشیافته تعدادی از این پیوندهای هیدروژنی از دست رفته بازیابی شدند. در مطالعه محتوای ساختار دوم با برنامه DSSPبا اتصال BMISCNبه جهشیافته درصد β-sheetنسبت به جهشیافته با 4۲درصد بدون تغییر ماند. چشم انداز انرژی آزاد در جهشیافته R115Gحداقلهای انرژی جهانی را داراست که در نهایت منجر به تبدیل اشتباه پروتئین به شکل آمیلوئیدی میشود اما با اتصال BMISCNبه جهشیافته ثبات ساختاری افزایش و تراکم کاهش پیدا کرد. برای مطالعه محتوای ساختار دوم، طیف سنجی FTIRدر ناحیه باند آمید (1600-1700 cm-1) Ιانجام شد که در آن با اتصال BMISCNبه جهشیافته R115Gنسبت به جهشیافته درصد cross β-sheetاز 1۱به 4درصد تغییر کرد که این نتایج با نتایج حاصل از DSSPمطابقت دارد. مطالعه فلورسانس ذاتی با شرایط القاء تجمعات آمیلوئیدی (DDT 1 mM, M )Tris-HCL 50 mM KSCN 0.16قرار گرفت و با افزایش غلظت BMISCNبه جهشیافته، شدت فلورسانس کاهش مییابد که نشاندهنده تغییر به سمت یک محیط قطبیتر در اطراف باقیماندههای تریپتوفان است. برای مشخص کردن اتصال BMISCNبه جهشیافته از فلورسانس خاموشی استفاده کردیم و میزان Ksvو Kqبه ترتیب ( ) 1/۲×14M-1S-1 8چکیده و ( ) 3/۲×143 M-1و میزان Kbو nبه ترتیب ( ) 11×144 M-1و ( )1به دست آمد. در فلورسانس خارجی با نشانگر ANSپروتئین در شرایط القاء تجمعات آمیلوئیدی قرار گرفت و به مدت 74ساعت انکوبه شد. در حالی که تفاوت معنیداری در شدت فلورسانس با یا بدون BMISCNو بدون زمان انکوباسیون مشاهده نشد، افزایش زمان انکوباسیون تا 14ساعت منجر به افزایش شدت فلورسانس شد که نشان دهندهی افزایش پاکتهای هیدروفوب میباشد. برای مطالعه کینتیک تشکیل آمیلوئید از فلورسانس ThTاستفاده شد. میزان Kappدر کمپلکس جهشیافته- BMISCNبا غلظتهای 34، 4 ، ۲4و ۰4میلی مولار به ترتیب 4/0۱ ،4/03 ،4/0۱و 4/3۲و میزان Tlagبه ترتیب 1۲ ،18 ،44و 1۲ساعت به دست آمد. از میکروسکوپ الکترونی عبوری برای بررسی مورفولوژی و تایید بیشتر تست ThTاستفاده شد و نتایج ما نشان داد گونههای متخلف تجمع ایجاد شدند اما اتصال BMISCNبه جهشیافته موجب کاهش گونههای تجمع و آمیلوئید شد. نتایج حاصل از مطالعه ما نشان داد که مایع یونی BMISCNخاصیت آنتی آمیلوئیدوژنیک داشته و میتواند به نوعی روند تشکیل آمیلوئید را مهار کند. از این رو، BMISCNمیتواند به عنوان یک کاندید مناسبی برای طراحی مهارکنندههای بسیار کارآمد در کاهش ALSکشنده و برگشت ناپذیر عمل کند.