باقر سیدعلیپور

اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) یک بیماری پیشرونده است که منجر به مرگ نورون های حرکتی در مغز و نخاع می شود. سوپراکسید دیسموتاز انسانی1(hSOD1) آنزیم آنتی اکسیدانی است که آنیون سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن و آب کاتالیز می کند. هر مونومر SOD1 به یک یون مس کاتالیزوری و یک یون روی ساختاری متصل می شود. بیش از۱۸۰جهش مختلف در ژن SOD1 در ارتباط با اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS)، گزارش شده است. درمطالعه حاضر با جایگزینی آسپارژین با سرین (N65S) واقع در لوپ اتصال روی (Loop IV) در اشکال آپو(بدون فلز) وهولو(فلزدارشده) تاثیر جهش بررسی شد. وکتور pET-28a- بعنوان الگو برای جهش زایی به روش Quick-change PCR استفاده شد. محصول PCR با استفاده از آنزیم DpnⅠ هضم و با استفاده از روش شیمیایی شوک حرارتی به سویه αDH5 باکتری E.coli منتقل گردید. پس از تعیین توالی جهش مورد نظر، پلاسمید به باکتریE.coli سویه یBL21(DE3) انتقال داده شد. برای بیان پروتئین از القاء کننده هایIPTG (1mM) و لاکتوزmM) 7) به مدت ۱۷تا ۱۹ ساعت در دمای ۲۲ درجه سانتی گراد انکوبه شد. و با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA آگارز تخلیص شد. سپس به منظور تایید خلوص پروتئین از SDS-PAGE استفاده شد. نتایج حاصل از شبیه سازی دینامیک مولکولی و سرورهای پیش بینی نشان داد که جهش و کمبود فلز منجر به تغییرات ساختاری در پروتئین شده است که به وسیله RMSD، RMSFو Rg تایید شد. سنجش فعالیت ویژه آنزیم مربوط به پروتئین apo/holo SOD1،U/mg ۳۵۰۰ و U/mg۵۸۸۵ و جهش یافته N65S apo/holo به ترتیب، U/mg ۱۰۳۹ وU/mg۱۹۰۰ بود که نسبت به آنزیم تیپ وحشی کمتر شده است. مطالعات FTIR در شرایط القاء آمیلوئید، تغییرات ساختار ثانویه را در جهش‌یافته نشان داد. کاهش و افزایش نشر فلورسانس ذاتی جهش یافته یapo/holo-N65S و نسبت به تیپ وحشی نشان دهنده تغییرات ساختاری و قرار گرفتن تریپتوفان در محیط قطبی و غیرقطبی است. همچنین افزایش و کاهش شدت نشر فلورسانس ANS در آپو و هولو جهش یافته نسبت به تیپ وحشی بیانگر افزایش و کاهش پاکت های آبگریز در سطح پروتئین می باشد. میزان k app در فرم هولو/آپو تیپ وحشی و جهش یافته به ترتیب (h -1 ۰۸۳/۰و۲۲/۰) ،(h -1 ۶۶/۰و۱۱/۰) بدست آمد. مطالعات پایداری شیمیایی با استفاده از گوانیدین کلراید برای محاسبه GºH2OΔ در فرم هولو/آپو تیپ وحشی و جهش یافته به ترتیب، kj.mol-1)۱۱ و۱/۶) ،kj.mol -1 ) ۲/۹ و۱/۴ (بدست آمد. این نتایج کاهش GºH2OΔ فرم آپو نسبت به هولو را نیز نشان داد. در این مطالعه، نتایج بیوانفورماتیک و مطالعات تجربی نشان داد که جهش N65S در فرم هولو و آپو می تواند به صورت موضعی ساختارو عملکرد پروتئین را تغییر داده و منجر به بدتاخوردگی پروتئین و افزایش تمایل به حدواسط های تجمعات آمیلوئیدی شود، که به درک بیماری زایی ALS کمک