باقر سیدعلیپور

اورات اکسیداز از خانواده اکسیدوردوکتازهاست که اکسیداسیون اسیداوریک را به 5-هیدروکسی ایزواورات و در نهایت الانتوئین کاتالیز می‌کند. اوریکاز یک پروتئین هموتترامر کروی با وزن مولکولی 135 کیلودالتون می‌باشد و هر مونومر دارای 302 اسیدآمینه و وزن مولکولی 5/34 کیلودالتون است. اوریکاز نوترکیب به نام راسبوریکاز به‌عنوان دارو در درمان بیماری‌های هایپراورسیمی و نقرس استفاده می‌شود. یکی از مشکلات پیش‌رو در استفاده از آنزیم‌ها به‌عنوان دارو پایداری کم آن‌ها در برابر حرارت است. در این پژوهش از روش جهش‌زایی هدف‌دار به منظور ایجاد آنزیم اوریکاز نوترکیب آسپرزیلوس فلاووس با پایداری حرارتی بهبود یافته استفاده کردیم. شبیه‌سازی دینامیک مولکولی به‌وسیله نرم افزار GROMACS 5.1.1 انجام شد. تغییرات ساختاری مانند تغییرات شعاع ژیراسیون(Rg)، انحراف میانگین مربع ریشه(RMSD)، نوسانات ریشه میانگین مربع(RMSF)، مساحت سطح قآبل دسترس به حلال ها(SASA) بررسی شد. در این پژوهش از پلاسمید pET-28a(+)حاوی ژن اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس در سویه BL21 باکتری E.coli استفاده کردیم. جهش نقطه‌ای به روش Quick-change PCR ایجاد شد. پلاسمیدها به‌وسیله شوک حرارتی به درون باکتری BL21 مستعد انتقال داده شد و بعد از استخراج و تایید باند مورد نظر بر روی ژل آگارز 1%، نمونه‌های جهش‌یافته جهت تعیین ترادف ارسال شدند. به منظور بیان پروتئین‌های وحشی و جهش‌یافته، باکتری BL21 به مدت 7 ساعت در دمای 37 درجه‌سانتی‌گراد انکوبه و با لاکتوز(8 میلی‌مولار) و IPTG (1 میلی‌مولار) القا شد و از کروماتوگرافی تمایلی برای خالص‌سازی پروتئین‌ها و از SDS-PAGE برای تایید خلوص پروتئین‌ها استفاده شد. غلظت آنزیم به روش بردفورد و با استفاده از آلبومین سرم گاوی به‌عنوان استاندارد تخمین زده شد. فعالیت آنزیم در حضور اوریک اسید به‌عنوان سوبسترا در طول موج 293 نانومتر تخمین زده شد. پارامترهای سنتیکی(Km and kcat, kcat/Km) آنزیم وحشی و جهش‌یافته در غلظت هایmM 2-004/0اوریک‌اسید به‌عنوان سوبسترا و در دمای 25 درجه‌سانتی‌گراد تعیین شد. به منظور بررسی پایداری حرارتی آنزیم‌ها در دماهای مختلف انکوبه شدند. برای بررسی پایداری حرارتی آنزیم در زمان‌های مختلف و غیرفعال‌سازی حرارتی برگشت ناپذیر، آنزیم‌ها در دماهای 30،40،50و60 انکوبه شدند. همچنین پایداری ذخیره‌سازی آنزیم وحشی و جهش‌یافته در دماهای(20-،4،25،37) به مدت 7 ماه بررسی‌شد. پایداری آنزیم در pH های مختلف در دمای 25 درجه‌سانتی‌گراد بررسی‌شد. برای مطالعه ساختارهای دوم و سوم، از روش‌هایی مانند طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه و فلورسانس ذاتی و خارجی استفاده ‌شد. از فاورسانس خاموش‌کننده به‌وسیله آکریل‌آمید برای بررسی رزیدوهای Trp در دسترس حلال پروتئین وحشی و جهش‌یافته استفاده شد. نمودارهای F0/F در مقآبل [Q] برای بررسی خاموش کردن فلورسانس استفاده شد. نتایج حاصل از RMSF و RMSDافزایش انعطاف‌پذیری در ناحیه جهش را نشان‌دادند، شعاع ژیراسون پروتئین جهش‌یافته نسبت به وحشی کاهش یافته است که نشان‌دهنده فشردگی ساختار است. فعالیت ویژه پروتئین جهش‌یافته و وحشی به ترتیب U/mg192/0 و U/mg 308/0 به دست آمد. مقدار Km، Kcat و کارایی کاتالیتیکی آنزیم جهش‌یافته به ترتیب (mM) 123/0 ، (s-1)17/0 و (1/ mM.s)6/1 و برای پروتئین وحشی (mM) 304/0 ، (s-1)4/0 و (1/ mM.s)3/1 محاسبه شد. دمای بهینه و pH بهینه برای آنزیم جهش‌یافته دمای 25 درجه‌سانتی‌گراد و pH برابر 5/8 به‌دست آمد و برای پروتئین وحشی به ترتیب 30 درجه‌سانتی‌گراد و pH برابر 9 محاسبه شد. ثابت غیرفعال شدن در دماهای ذکر شده برای پروتئین جهش‌یافته نسبت به پروتئین وحشی افزایش یافت که بیان‌کننده کاهش نیمه عمر پروتئین جهش‌یافته در این دماها می‌باشد. پروتئین وحشی و جهش‌یافته در دمای 4 درجه‌سانتی‌گراد بهترین پایداری ذخیره‌سازی را نشان‌دادند و در دمای 25 درجه‌سانتی‌گراد پایداری ذخیره‌سازی جهش‌یافته به‌طور نسبی نسبت به وحشی بهتر عمل‌کرد. مطالعات ساختار دوم به‌وسیله FT-IR و شبیه‌سازی دینامیک مولکولی افزایش ساختارثانویه Heix-α و کاهش ساختارثانویه Sheet-β نشان‌داد. مطالعات طیف‌سنجی ذاتی نشان‌دهنده افزایش شدت نشر پروتئین جهش‌یافته است که حاکی از تغییر موضعی و تغییر ریز محیط اطراف تریپتوفان و قرار گرفتن تریپتوفان در محیط غیرقطبی است. طیف‌سنجی فلورسانس خارجی با نشانگرANS، کاهش شدت نشر و طیف‌سنجی خاموش کننده، خاموشی کم‌تر جهش‌یافته را نشان داد که هر دو بیان کننده فشردگی ساختار پروتئین جهش‌یافته نسبت به پروتئین وحشی هستند. جهش ایجاد شده سبب ایجاد پروتئین با ویژگی جدید شد که می‌توان از آن به‌عنوان گزینه‌ای برای درمان استفاده کرد.